納米抗體(nanobody,Nb)仿佛是免疫系統(tǒng)中的精靈,對應(yīng)于駱駝科中表達(dá)的IgG2和IgG3的重鏈可變 結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域沒有CH1結(jié)構(gòu)域和輕鏈,是能夠保持原始全抗結(jié)合親和力和特異性的最小抗體片段的代表,它們以14kDa的嬌小身形展示了納米抗體的魅力。
相對于傳統(tǒng)的IgG(150kDa)的巨人,納米抗體(nanobody,Nb)的微小尺寸似乎賦予了它與病毒隱秘表位結(jié)合的獨(dú)特能力,這一特性在如今可能特別適用于生產(chǎn)適用于病毒研究的試劑。多年來,納米抗體(nanobody,Nb)一直作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表征的有效伴侶和分子工具,是半衰期極短的放射性同位素的方便載體,可應(yīng)用于體內(nèi)PET/SPECT成像。最近,科學(xué)家們特別欣賞納米抗體的最小尺寸,他們正在尋找適合優(yōu)化超分辨率顯微鏡性能的粘合劑,并產(chǎn)生串聯(lián)嵌合抗原受體(CAR)。由于可以同時結(jié)合多種抗原而顯示出更高的靶標(biāo)特異性。納米抗體(nanobody,Nb)的短序列使它們成為理性誘變和計算機(jī)改善生物物理特征的最簡單抗體衍生候選者。
納米抗體(nanobody,Nb)技術(shù)的優(yōu)勢得到了廣泛關(guān)注,隨著限制其使用的專利到期后,對納米抗體的關(guān)注呈指數(shù)級增長。根據(jù)PubMed統(tǒng)計數(shù)據(jù),納米抗體相關(guān)的出版物在20年前只是鳳毛麟角,然而到了2010年已經(jīng)發(fā)展為每年十篇,到2019年更是增加到每年數(shù)百篇,這意味著納米抗體(nanobody,Nb)的應(yīng)用更加廣泛了,也意味著從納米抗體(nanobody,Nb)分離開始,到生產(chǎn)、工程和開發(fā)成熟免疫試劑的過程中的任何步驟都提出了更優(yōu)的方案。例如,納米抗體可以根據(jù)對物理和化學(xué)條件的抵抗力或因為對確定的抗原表位具有特異性而進(jìn)行選擇。一旦被選中,這種可克隆分子可以直接作為(融合)免疫試劑生產(chǎn),具有選定的功能特征、不同的形式和結(jié)構(gòu)域組合。目前,大量載體可用于在原核和真核系統(tǒng)中生產(chǎn)定制的納米抗體(nanobody,Nb),這些載體根據(jù)它們必須具有的功能特征服務(wù)于其最終應(yīng)用。
那么在制備納米抗體(nanobody,Nb)時,應(yīng)該如何在哺乳動物和細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)之間進(jìn)行選擇?
由于納米抗體(nanobody,Nb)通??梢栽诩?xì)菌中以功能性且高產(chǎn)量的方式表達(dá),但當(dāng)納米抗體必須作為作為粘合劑在體內(nèi)起作用時,它們也可能需要在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá),因此將它們引入哺乳動物細(xì)胞這類更為昂貴且條件苛刻的系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)是合理的。普健生物哺乳動物細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)支持瞬時表達(dá)、穩(wěn)定表達(dá)及穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建等多種表達(dá)方式,提供pcDNA3.1,plRES,pTT3,pCEP4,pATX1等多種表達(dá)載體,技術(shù)團(tuán)隊擁有十余年豐富的蛋白表達(dá)經(jīng)驗,成功完成5000+哺乳表達(dá)項目,200+穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建項目,能為您提供表達(dá)載體構(gòu)建、瞬時轉(zhuǎn)染、表達(dá)測試及大規(guī)模動物細(xì)胞發(fā)酵和蛋白純化等一站式蛋白技術(shù)服務(wù)。
另外,普健生物XtenCHOTM高密度瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng)是由普健生物自主研發(fā)的用于高效表達(dá)蛋白抗體高密度瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng),XtenCHOTM細(xì)胞是普健生物開發(fā)的一種經(jīng)基因改造的CHO細(xì)胞株,使用含配套元件的載體,可以使轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的表達(dá)載體拷貝數(shù)增加,延長游離質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的停留時間,從而使載體攜帶的目的基因獲得高水平,持續(xù)表達(dá)。XtenCHOTM高密度瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng)改進(jìn)了CHO常規(guī)轉(zhuǎn)染方法,采用新穎的高密度轉(zhuǎn)染方法和特殊的細(xì)胞培養(yǎng)模式,提高了轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活率,使轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活時間從常規(guī)6-7天延長至10-14天,進(jìn)一步提高了目的蛋白的產(chǎn)量。XtenCHOTM高密度瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑、表達(dá)培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基相較于常用的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、商業(yè)化CHO瞬轉(zhuǎn)培養(yǎng)基以及補(bǔ)料培養(yǎng)基,成本大大降低,更適用于工業(yè)生產(chǎn),在規(guī)模較大的重組蛋白瞬時表達(dá)生產(chǎn)中更能體現(xiàn)其性價比高的特點。
(由于納米抗體(nanobody,Nb)通常可以在細(xì)菌中以功能性且高產(chǎn)量的方式表達(dá),但當(dāng)納米抗體必須作為作為粘合劑在體內(nèi)起作用時,它們也可能需要在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá),因此將它們引入哺乳動物細(xì)胞這類更為昂貴且條件苛刻的系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)是合理的。我們的哺乳動物細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)支持瞬時表達(dá)、穩(wěn)定表達(dá)及穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建等多種表達(dá)方式,提供pcDNA3.1,plRES,pTT3,pCEP4,pATX1等多種表達(dá)載體,可用于納米抗體高質(zhì)高量表達(dá),助力納米抗體在基礎(chǔ)科學(xué)研究中大規(guī)模的廣泛應(yīng)用。
其中自主開發(fā)的XtenCHOTM用于高效表達(dá)蛋白抗體高密度瞬轉(zhuǎn)表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)表達(dá)量高(一般為200-400mg/L,部分抗體的表達(dá)量高達(dá)1g/L),工藝簡單,有利于高通量抗體表達(dá)。)
在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的納米抗體(nanobody,Nb)不僅需要在細(xì)胞質(zhì)的還原環(huán)境中產(chǎn)生并保持其功能。在這種情況下,體內(nèi)的體內(nèi)表達(dá)受到時間控制,以在非常特定的時刻誘導(dǎo)粘合劑積累。這些納米抗體的應(yīng)用領(lǐng)域廣泛,比如熒光納米抗體可以在宿主細(xì)胞的確定生理階段表達(dá),以跟蹤相應(yīng)抗原的命運(yùn),而不會干擾其活性,并通過這種方式特異性標(biāo)記不同的抗原和亞細(xì)胞區(qū)域。
它們相較于傳統(tǒng)抗體,納米抗體的優(yōu)勢在于其結(jié)構(gòu)簡單,僅需單個二硫鍵就能實現(xiàn)穩(wěn)定和功能性折疊。因此,它們中的很大一部分可以在細(xì)胞質(zhì)中實現(xiàn)正確折疊,并不必然需要經(jīng)過細(xì)胞分泌途徑。這種情況已被用于設(shè)計體內(nèi)抗體,以競爭其抗原與細(xì)胞中存在的其他分子結(jié)合其抗原的特定表位或免疫沉淀其靶標(biāo)以損害聚集的病理過程。通過將目標(biāo)蛋白標(biāo)記并與識別標(biāo)簽的納米抗體結(jié)合使用,實現(xiàn)了研究真核細(xì)胞中靶蛋白功能可能性。具有體內(nèi)特征的抗標(biāo)簽納米抗體已被成功用于誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的可視化、降解、重新定位、捕獲和修飾。
畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已被提議作為替代真核生物的生產(chǎn)重組納米抗體的蛋白表達(dá)系統(tǒng),具有許多優(yōu)勢。首先,畢赤酵母是一種真菌,它具有高效的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制,可以快速地合成和分泌大量的蛋白質(zhì)。其次,畢赤酵母可以高密度培養(yǎng),并且對工業(yè)生產(chǎn)中的許多不利條件具有抵抗力,例如高溫、高酸度等。此外,畢赤酵母的基因組背景已經(jīng)得到了深入研究,因此可以進(jìn)行基因敲除或過表達(dá)以增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的產(chǎn)量或者改進(jìn)蛋白質(zhì)的性質(zhì)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有潛力應(yīng)用于生產(chǎn)重組納米抗體,但仍需要進(jìn)行更多的研究和優(yōu)化。與真核生物表達(dá)系統(tǒng)相比,畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有更廣闊的應(yīng)用前景和更高的生產(chǎn)效率。
生產(chǎn)重組納米抗體的最常規(guī)方法是促進(jìn)其在大腸桿菌周質(zhì)中的分泌??蒲腥藛T通常會利用一種被稱為“免疫庫”的技術(shù)。免疫庫是一種通過計算機(jī)輔助設(shè)計的人工免疫系統(tǒng),能夠高效地生成和優(yōu)化納米抗體以對抗特定的疾病。通過將免疫庫引入大腸桿菌,科學(xué)家可以刺激細(xì)菌分泌特定的納米抗體,以對抗多種疾病,包括癌癥、自身免疫疾病和神經(jīng)退行性疾病等??偟膩碚f,由于大腸桿菌是一種常用的微生物,因此利用其生產(chǎn)納米抗體的工藝相對成熟。利用大腸桿菌生產(chǎn)重組納米抗體的方法具有許多優(yōu)勢,如成本較低,這使得這種方法在臨床應(yīng)用隨上著具科有技很的大不的斷潛發(fā)力展。
納米抗體的表達(dá)以及與具有正交功能的標(biāo)簽融合的納米抗體的多樣化表達(dá),正在迅速發(fā)展。為了獲得具有高度差異化特征的試劑,滿足不斷變化的最終應(yīng)用需求,它們的生產(chǎn)逐漸依賴于各種不同的表達(dá)條件。 此外,我們越來越深刻地認(rèn)識到納米抗體的結(jié)構(gòu)比最初想象的要更為復(fù)雜。具體來說,納米抗體不具有單一、高度均勻的傘形,而是結(jié)合了許多不同的3D構(gòu)象。這些構(gòu)象同樣可以涉及框架殘基,并賦予它們多個可選擇的表面來與抗原相互作用。雖然目前缺乏實驗報告,但可以預(yù)見的是,不同VHH亞型的折疊要求也應(yīng)該是多變的。
總的來說,在選擇蛋白表達(dá)系統(tǒng)制備用于不同研究方向的納米抗體時,我們需要基于納米抗體的科研領(lǐng)域來生產(chǎn)高質(zhì)高量高產(chǎn)的試劑,以滿足未來對功能可靠性的嚴(yán)苛要求。