靶向破壞宿主免疫的病原體進行重組抗體的設(shè)計和開發(fā)策略

人口密度、旅行頻率和免疫受損個體數(shù)量的增長增加了病原體致病的機會。重組抗體技術(shù)可以幫助確定病原體的免疫逃逸機制，并通過識別功能相關(guān)的抗體靶點、改造抗體使抗體逃逸策略無效以及捕獲隱藏在宿主細胞內(nèi)的病原體來對抗病原體的免疫逃逸機制。

結(jié)合保守和可及靶點的抗體通常需要宿主免疫應(yīng)答來預(yù)防或化解感染。在這些情況下，調(diào)理過的病原體可通過多種機制被破壞，包括補體溶解、吞噬作用或NK介導(dǎo)的對受感染細胞的殺傷。例如，簡單地用抗體標記病原體，通過Fc受體而不是自然入侵途徑介導(dǎo)吞噬作用，就可以將病原體送到溶酶體進行破壞。作為應(yīng)答，細菌和病毒病原體進化出了逃避這些保護性免疫功能的策略，包括破壞補體級聯(lián)或削弱宿主免疫細胞捕獲和破壞內(nèi)化病原體能力的蛋白質(zhì)。阻斷免疫逃逸蛋白的抗體可以恢復(fù)免疫功能，而工程抗體可以靶向隱蔽的細胞壁龕中的細菌。
保護補體活性的抗體
經(jīng)典補體途徑被大量表面抗原激活，這些表面抗原使IgG抗體能夠結(jié)合和六聚化，或者更有效地與天然五聚體或六聚體IgM分子結(jié)合(Figure 4)。這些抗體隨后可與C1q蛋白的6個球狀頭結(jié)合，從而激活蛋白水解級聯(lián)。由此導(dǎo)致的C3b沉積在病原體表面，通過與白細胞上的補體受體(尤其是補體受體3)結(jié)合介導(dǎo)吞噬作用。如果C3b密度高，則可形成裂解膜攻擊復(fù)合物來裂解革蘭陰性菌和病毒粒子。因為不是所有的抗原都在空間上排列以支持IgG六聚體的有效形成，殘基的變化(E430G和E345K或-R)被確定為獨立增加Fc-Fc相互作用支持六聚體的形成，導(dǎo)致C1q結(jié)合增加和5 - 7倍的補體激活。當與靶向保守淋病奈瑟菌脂寡糖表位的抗體結(jié)合時，與未修飾的Fc相比，這些經(jīng)過改造的HexaBody Fc結(jié)構(gòu)域通過僅需要補體激活的機制介導(dǎo)了小鼠體內(nèi)細菌清除的增強。
補體逃避策略在細菌病原體中常見，包括產(chǎn)生膠囊以保護抗體接觸到抗原、招募補體抑制劑的表面抗原和切割補體蛋白的蛋白酶(Figure 4)。靶向這些抗原的抗體可同時阻斷抑制劑與抑制劑的結(jié)合，并將C1q招募到病原體表面，從而起到殺滅細菌的作用。與奈瑟氏菌結(jié)合的抗體最有力地證明了這一點，奈瑟氏菌是細菌性腦膜炎和膿毒癥的一個重要原因，經(jīng)典補體途徑在殺菌作用中占主導(dǎo)地位。
然而，fHBP被推測在血清中與fH形成復(fù)合物，這將限制保護性抗體的產(chǎn)生，而保護性抗體可競爭性抑制fH/fHBP的相互作用。為了解決這一問題，研究人員利用重組技術(shù)開發(fā)了fH免疫原，改良后的fHBP免疫恒河猴后，血清IgG滴度比原fHBP提高3倍，血清殺菌滴度比原fHBP提高150倍，這與補體成分C4b在活菌上沉積增加有關(guān)。這些數(shù)據(jù)提示，靶向其他生物體表達的逃避補體的抗原可能支持疫苗研發(fā)工作。

Figure 4? Microbial disruption of the classical complement cascade by recruiting inhibitors or degrading complement proteins. Key steps of the classical pathway of antibody activation are shown: ① The complement proteins C1q and then C1r and C1s bind hexamerized IgG or IgM on the pathogen surface to form the C1 complex. ② Complement components C2 and C4 are cleaved to produce membrane-bound C4b and C2a, which form the C3 convertase. ③ This cleaves C3 to release C3a and deposit C3b covalently on the membrane. ④ When C3b levels are high, it joins the C3 convertase to form the C5 convertase, which cleaves C5 to release C5a and deposit C5b on the membrane. ⑤ Components C6–C9 join C5b to form the membrane attack complex and osmotically lyse the target membrane. Released C3a and C5a are chemoattractants for leukocytes, while membrane-bound C3b can engage complement receptors such as CR3 to trigger phagocytosis. The lectin pathway follows a similar cascade but is initiated by the mannose-binding lectin complex, which recruits C1q; the alternate pathway results from spontaneous C3 cleavage and C3b deposition to enter at the C3 convertase step using an alternate C3b/Bb complex. Many of these steps can be inhibited by pathogen components, including proteins that bind or cleave Fc to inhibit C1q recruitment (e.g., protein A and staphylokinase), proteins that recruit host complement regulators (e.g., the Neisseria fHBP, which recruits fH, and Bordetella pertussis Vag8, which recruits C1 inhibitor), and enzymes that degrade complement components (e.g., staphylokinase depletes C3). Engineering efforts to overcome these strategies include the use of HexaBodies, which favor C1q binding; antibodies resistant to capture by Fc-binding proteins or cleavage by bacterial proteases; and antibodies that block recruitment of complement inhibitors such as factor H. Abbreviations: fH, factor H; fHBP, factor H binding protein. Adapted from images created with BioRender.
保護白細胞功能的抗體
許多細菌產(chǎn)生白細胞毒素，而白細胞毒素會損害免疫細胞捕獲和摧毀病原體的能力。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生一系列具有冗余互補功能的殺白細胞素，包括α-溶血素(Hla)和5種雙組分細胞毒素HlgAB、HlgCB、LukSF、LukED和LukGH。
一旦調(diào)理抗體結(jié)合病原體表面的保守表位，白細胞毒素的分泌可能會限制吞噬之前或之后的細菌殺滅。在這種情況下，阻斷白細胞毒素活性的抗體有望與調(diào)理抗體產(chǎn)生協(xié)同作用。Tkaczyk等表明，在金黃色葡萄球菌感染的致死性肺炎和菌血癥模型中，與調(diào)理抗體結(jié)合的ClfA與中和抗體的Hla有協(xié)同作用。
靶向內(nèi)化細菌的抗體-抗生素偶聯(lián)物
雖然傳統(tǒng)上認為胞內(nèi)細菌具有專性或兼性胞內(nèi)生活方式，但越來越多的人認識到，被吞噬的細菌可以作為活生物體的儲存庫，以種子感染。例如，金黃色葡萄球菌很容易被巨噬細胞和中性粒細胞吞噬。雖然大多數(shù)內(nèi)化的細菌被殺死，但有一部分抵抗殺死，并利用吞噬細胞介導(dǎo)擴散到其他部位。對于金黃色葡萄球菌來說，細胞內(nèi)存活幫助細菌逃避固有免疫防御，并通過程序性壞死破壞中性粒細胞，殺白細胞素通過誘導(dǎo)程序性壞死介導(dǎo)細菌生存/逃逸。此外，許多病毒在低PH核內(nèi)體中進行進入宿主細胞所需的膜融合事件(例如流感和埃博拉病毒)。在這兩種情況下，免疫系統(tǒng)、抗體和抗生素基本上無法接觸到細胞內(nèi)的病原體。巧妙的工程策略可以向這些細胞內(nèi)生物遞送多功能抗體，從而支持通過天然免疫細胞功能或聯(lián)合遞送抗生素來破壞病原體。
調(diào)理抗體已被設(shè)計用于將抗生素或其他抗毒分子與細胞內(nèi)病原體共定位。多功能抗體-抗生素偶聯(lián)物依賴于與豐富的細菌表面抗原結(jié)合的抗體成分，將其標記為吞噬入核內(nèi)體，核內(nèi)體可能含有之前內(nèi)化的細菌（Figure 5a）。在體外，抗體-抗生素偶聯(lián)物殺死了巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞內(nèi)化的細菌。

Figure 5? Antibodies that target intracellular pathogens. (a) Antibody–antibiotic conjugates bind bacterial surface antigens and are internalized with the bacteria by natural or phagocytic mechanisms. Once internalized, the antibiotic is released by resident enzymes to kill co-localized bacteria. (b) Bispecific antibody MEDI3902 uses one binding site to bind the Psl surface antigen on Pseudomonas aeruginosa and mediate phagocytosis. After translocation to the endosome, the second antibody-binding site blocks type III secretion to support endosome acidification and bacterial killing. (c) The mannose-6-phosphate receptor can mediate antibody transfer to an endolysosome that may already contain Ebola virions. Once co-localized, the antibody can block Ebola–receptor interactions to prevent viral escape into the cellular cytosol. Adapted from images created with BioRender.
這一策略耗盡了不易接近的細菌儲存庫，否則這些儲存庫將成為反復(fù)感染的來源。雖然殺菌活性是新型抗生素的關(guān)鍵要求，但這些分子通常也具有不良的宿主毒性。與抗體結(jié)合的益處是降低治療劑量，同時延長循環(huán)半衰期，并在釋放前將抗生素定位到感染部位。
這種策略可以減少全身毒性，同時在吞噬體內(nèi)達到殺滅細菌所需的高局部抗生素濃度。它可能也適用于專性病原體，例如伯克霍爾德菌屬。
用于獲取內(nèi)化病原體的雙特異性抗體
雙特異性抗體使用類似的方法，其中一個結(jié)合位點標記病原體，使其被吞噬，而另一個發(fā)揮互補功能，如阻斷使細胞內(nèi)位點適合病原體的毒力因子。這類藥物中最先進的方法是MEDI3902，該藥物最近完成了Ⅱ期臨床試驗(NCT02696902)。雙特異性抗體的產(chǎn)生是通過一組阻斷核內(nèi)體pH的受體結(jié)合位點，而另一組通過結(jié)合病毒粒子上保守的非中和表位來介導(dǎo)吞噬和核內(nèi)體遞送。這一概念可以擴展到阻斷其他蛋白質(zhì)的功能，這些蛋白質(zhì)支持病原體逃逸或維持內(nèi)體作為病原體的適宜環(huán)境，例如金黃色葡萄球菌白細胞毒素。
上述策略需要抗體和病原體在內(nèi)化之前相互作用，這可能為治療已確立的感染或清除所有細胞內(nèi)病原體帶來挑戰(zhàn)。作為替代方案，抗體可以單獨遞送，與已經(jīng)存在于核內(nèi)體或溶酶體中的病原體結(jié)合。這可以通過胞飲作用和FcRn介導(dǎo)的抗體跨上皮細胞轉(zhuǎn)運發(fā)生；在這一過程中，含有抗體的內(nèi)體可以與含有流感病毒顆粒的內(nèi)體融合，從而中和血凝素，防止流感病毒與宿主細胞膜融合。
這里描述了三種互補的策略來靶向隱藏在細胞內(nèi)的病原體?？贵w可阻斷阻止宿主細胞殺死內(nèi)化細菌的細胞毒素活性，或者可介導(dǎo)將抗生素和細菌靶向遞送至吞噬體，從而殺滅細胞內(nèi)細菌。在這兩種情況下，確定細菌表面抗原作為抗體靶點，并在吞噬之前將抗體與病原體結(jié)合對于成功進行吞噬至關(guān)重要。較新的方法將保護性抗體靶向遞送到已經(jīng)含有病原體的細胞內(nèi)區(qū)室，可能對于已發(fā)生的感染有優(yōu)勢。
任何新的策略都可能施加選擇壓力，促使性狀發(fā)生改變的生物體出現(xiàn)。然而，許多病原體的持續(xù)存在以及新病原體的出現(xiàn)強調(diào)了預(yù)防和改善感染的創(chuàng)新方法的必要性。