| 種類 | 研究對象 | 結(jié)合技術(shù) |
|---|---|---|
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染色質(zhì)免疫沉淀 (CHIP) |
DNA-蛋白質(zhì) | PCR |
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蛋白質(zhì)免疫沉淀 (PIP) |
抗原-抗體 | 蛋白免疫印跡 |
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放射免疫沉淀 (RIP) |
抗原-抗體 | 放射性同位素技術(shù) |
當(dāng)然，再結(jié)合其他技術(shù)還可以衍生出更多的技術(shù)，本篇先來剖析一下染色質(zhì)免疫沉淀（CHIP）。
CHIP染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP) 是研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。其原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。后期通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。
應(yīng)用：ChIP可以用來檢測體內(nèi)反式作用因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。而且，ChIP與其他方法的結(jié)合擴大了其應(yīng)用范圍：ChIP與基因芯片相結(jié)合建立的ChIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；ChIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。
甲醛處理細(xì)胞
2收集細(xì)胞，超聲破碎
3加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合
4加入ProteinA，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物，沉淀
5對沉淀下來的復(fù)合物進(jìn)行清洗，除去一些非特異性結(jié)合
6洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物
7解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷
8PCR或基因芯片分析
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勤勤懇懇，辛辛苦苦操作了老半天翹首以待實驗成果
然后有人歡喜有人憂
怎么把“驚嚇”變成“驚喜”
this is a question
只要找到破解方法，
所有的問題都不是問題！
今天我們就來一一擊破
免疫沉淀系列實驗中那些揪心的問題。
| 原因 | 方案 |
|---|---|
| 洗滌不充分 | 離心前蓋上管蓋反復(fù)顛倒幾次 |
| 抗體濃度太高 | 檢查推薦抗體用量，嘗試使用更少的抗體 |
| 抗體特異性不夠 | 使用親和純化的抗體，最好預(yù)先吸收 |
| 封閉不充分 | 優(yōu)化封閉時間/溫度，室溫封閉1小時或4℃封閉過夜 |
| 封閉液中與其他蛋白發(fā)生抗體的交叉反應(yīng) | 換一種不同的封閉液；不要用含抗生素蛋白的牛奶封閉，牛奶含生物素 |
| 操作設(shè)備被污染 | 保證電泳儀器、印跡儀器和孵育用容器清潔，無外源污染物 |
| 原因 | 方案 |
|---|---|
| 蛋白未轉(zhuǎn)到膜上 | 可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時間和電流 |
| 一抗、二抗等不匹配 | 選擇針對一抗來源的種屬抗體 |
| 過度封閉 | 使用含0.5%脫脂奶粉或無脫脂奶的抗體稀釋液；試用不同的封閉液；減少封閉時間 |
| 洗膜過度 | 洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用0.05%的弱去垢劑Tween-20 |
| 曝光時間太短 | 延長膠片的曝光時間，超感應(yīng)化學(xué)發(fā)光底物會持續(xù)發(fā)光至少6個小時 |
| 原因 | 方案 |
|---|---|
| 細(xì)胞傳代次數(shù)過多，蛋白表達(dá)模式分化 | 使用原始或傳代少的細(xì)胞株或進(jìn)行平行實驗 |
| 樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解 |
使用新鮮制備的標(biāo)本并使用蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作 |
| 一抗不純 | 使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶 |
| 一抗特異性不高 | 重新選擇或制備高特異性的抗體 |
如果你的WB實驗出現(xiàn)了這些問題，
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