很多人不知道，抗體藥物研發(fā)，最關(guān)鍵的一步是。。。
咨詢，問對(duì)人很重要
一個(gè)雙特異性抗體藥與普健的故事，四年征程，未完待續(xù)。。。
那是風(fēng)和日麗的一個(gè)下午，叮咚~
一條消息跳了出來，“要開發(fā)雙特異性抗體藥物，你們有專家嗎？”
“我們的抗體藥物專家經(jīng)驗(yàn)豐富，曾經(jīng)成功開發(fā)過上市治療性抗體藥物，可以針對(duì)具體需求進(jìn)行個(gè)性化設(shè)計(jì)。AtaGenix將全程為您服務(wù)?！?nbsp;
隨后，一項(xiàng)歷時(shí)四年的工程由此展開。
目標(biāo)：開發(fā)一種雙特異性抗體藥物，通過連接CD3抗體，增強(qiáng)針對(duì)某類特定腫瘤細(xì)胞A的免疫系統(tǒng)識(shí)別能力。
要開發(fā)雙特異性抗體，我們得先分別獲得抗單種抗原的鼠單抗---CD3抗體和腫瘤抗原A的抗體。然后進(jìn)行，對(duì)正確組裝后的雙抗進(jìn)行檢測(cè)，最終實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。
路得一步一步走，每一步都很關(guān)鍵。
這就需要我們的單克隆抗體開發(fā)技術(shù)（點(diǎn)擊可查看技術(shù)詳情）。
要求：得到的單克隆抗體可用于流式細(xì)胞術(shù)（FC）檢測(cè)特定的人細(xì)胞膜蛋白。這些抗體將被用于人類細(xì)胞和小鼠的體外試驗(yàn)。已知目標(biāo)蛋白在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)里很難表達(dá)，但我們就是解決困難的。
接下來，沿著單克隆抗體開發(fā)流程，看一下我們是怎樣做到的。
01抗原制備經(jīng)過預(yù)測(cè)和評(píng)估，我們選擇了目標(biāo)蛋白的一個(gè)片段在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。
雖然，該基因是針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)而設(shè)計(jì)和優(yōu)化的。
但是，我們向來不只做單一準(zhǔn)備，永遠(yuǎn)備有為客戶準(zhǔn)備的Plan B。So，除了哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，我們還選了大腸桿菌作為備用系統(tǒng)。兩種表達(dá)方案同時(shí)進(jìn)行，最終獲得滿足條件的抗原。
用原始抗原免疫五只小鼠，并篩選陽性血清。
為了篩選到符合要求的抗體，我們將綠色熒光蛋白GFP與抗原蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中融合表達(dá)，通過FITC信號(hào)將表達(dá)GFP的細(xì)胞篩選出來，作為流式分析抗體特異性的陽性細(xì)胞；并使用能夠識(shí)別GFP的一抗作為陽性抗體對(duì)照，來篩選特異性抗體。
流式分析檢測(cè)結(jié)果(GFP抗體和GFP陽性細(xì)胞百分比)：
流式檢測(cè)中對(duì)抗原免疫原性最強(qiáng)的為3號(hào)小鼠血清，4號(hào)次之，我們決定對(duì)小鼠3號(hào)和4號(hào)進(jìn)行融合。
03細(xì)胞融合、亞克隆及生產(chǎn)將篩選出的兩只小鼠脾細(xì)胞分別進(jìn)行融合、亞克隆，F(xiàn)C檢測(cè)保留最佳陽性抗體，最終獲得最佳的30株抗腫瘤抗原A候選單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
看一下我們都做了哪些工作?
a. 對(duì)3號(hào)小鼠細(xì)胞融合后的上清，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，從中篩選出42株陽性細(xì)胞株（下表）。
b. 對(duì)3號(hào)小鼠細(xì)胞融合后的上清，進(jìn)行FC檢測(cè)，從中篩選出14株陽性細(xì)胞株（下表）。
c. 生產(chǎn)的抗體，進(jìn)行FC檢測(cè)，從中篩選出30株陽性細(xì)胞株（下表）。
小結(jié)
經(jīng)過多系統(tǒng)表達(dá)測(cè)試，我們成功地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重組表達(dá)了目標(biāo)抗原，開發(fā)出對(duì)抗原具有良好親和力和特異性的單克隆抗體。最終，我們生產(chǎn)并純化得到了30株抗腫瘤抗原A抗體的單克隆細(xì)胞株，產(chǎn)生的抗體均可以在流式細(xì)胞術(shù)中成功識(shí)別抗原。
抗腫瘤抗原A雜交瘤測(cè)序獲得鼠單抗的VH和VL序列。
做了8個(gè)嵌合抗體的表達(dá)純化，將8個(gè)嵌合抗體和1個(gè)原始雜交瘤細(xì)胞純化得到的抗體進(jìn)行ELISA驗(yàn)證，用Biacore檢測(cè)了這9個(gè)抗體的親和力，篩選到了高親和力的嵌合抗體。
表達(dá)了18個(gè)人源化抗體，將18個(gè)人源化抗體、原始雜交瘤細(xì)胞純化得到的抗體及篩選得到的最佳嵌合抗體，進(jìn)行ELISA驗(yàn)證，用Biacore檢測(cè)了這20個(gè)抗體的親和力，篩選得到高親和力抗體。
接下來，是最關(guān)鍵的一步。別眨眼哦！
目標(biāo)：抗腫瘤抗原A和CD3的雙特異性抗體
01不同類型雙特異性抗體設(shè)計(jì)我們已獲得3個(gè)抗腫瘤抗原A抗體，1個(gè)抗CD3抗體。
AB1（前期項(xiàng)目中開發(fā)并測(cè)序的小鼠雜交瘤單克隆抗體）
AB2和AB3（通過噬菌體展示開發(fā)的人源單克隆抗體）
AB4 （AB4h）是在專利中公開的的抗CD3人源化抗體
我們的抗體設(shè)計(jì)專家設(shè)計(jì)了3種類型的雙特異性抗體，即CrossMAb，IgG-like format using DuoBodies，and IgG-like bivalent Fab-Fab-Fc format。
02基因合成和亞克隆將cDNA序列亞克隆到AtaGenix特有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pTXs1中，本項(xiàng)目共使用21個(gè)表達(dá)質(zhì)粒（下表）：
總共16種抗腫瘤抗原A和抗CD3的重組抗體片段用于測(cè)試。
表達(dá)測(cè)試結(jié)果如下：
CrossMAbs類型重組抗體表達(dá)純化測(cè)試
結(jié)果表明，CrossMAbs是表達(dá)的，但沒有以完整的雙特異性抗體結(jié)構(gòu)組裝，處于半形成狀態(tài)。
DuoBodies類型重組抗體表達(dá)純化測(cè)試
No.7: AB1重組抗體；No.8: AB2重組抗體；No.9: AB3重組抗體；No./10: AB4重組抗體
Bivalent Fab-Fab類型重組抗體表達(dá)純化測(cè)試
重組抗體QC結(jié)果（還原膠和非還原膠）
結(jié)果顯示，對(duì)于DuoBodies和Bivalent Fab-Fab抗體類型，正確地產(chǎn)生了完整的雙特異性抗體結(jié)構(gòu)。
值得一提的是，我們整個(gè)表達(dá)純化過程對(duì)內(nèi)毒素進(jìn)行了有效的控制和去除，將內(nèi)毒素控制在<0.1EU/mg。
04Fab臂交換重組DuoBodies上面獲得的DuoBodies類型重組抗體，目前只能特異識(shí)別單一抗體，如何將兩種抗體組合連接，就需要神奇的Fab臂交換技術(shù)。
通過特定的條件，進(jìn)行Fab臂交換重組抗腫瘤抗原A抗體和抗CD3抗體，形成雙特異性抗體。
對(duì)交換重組的雙特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)：
重組DuoBodies抗體QC結(jié)果（還原膠和非還原膠）
1：No.7+No./10；2：No.8+No./10；3：No.9+No./10
重組DuoBodies抗體產(chǎn)量及純度
05重組雙特異性抗體檢測(cè)分析5.1）SEC-HPLC Analysis
SEC-HPLC檢測(cè)結(jié)果表明，No.7+No./10重組雙特異性抗體濃度最高，是由兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈組成的理想雜合四聚體。No.8+No./10重組抗體有一些降解或未組裝完全，No.9+No./10重組抗體顯著降解或組裝較少。
5.2）ELISA滴定
ELISA滴定法同時(shí)測(cè)定雙特異性抗體和以前獲得的親本抗體(AB1、AB2和AB3)對(duì)腫瘤抗原A和CD3的結(jié)合能力。
針對(duì)腫瘤抗原A結(jié)合檢測(cè)
針對(duì)CD3結(jié)合檢測(cè)
檢測(cè)結(jié)果顯示，所有陽性對(duì)照與預(yù)期一致。
DuoBodies和Bivalent Fab-Fab抗體與腫瘤抗原A和CD3結(jié)合良好，說明這兩類重組雙特異性抗體構(gòu)建正確。雖然CrossMAbs類型抗體也會(huì)結(jié)合，但它們的結(jié)合很可能是由半合成狀態(tài)的抗體造成的。
項(xiàng)目的順利推動(dòng)，其中包含2000多封郵件溝通，30多個(gè)技術(shù)人員辛勤實(shí)驗(yàn)，歷時(shí)4年，中法科學(xué)家通力合作。
目前，其中一個(gè)雙特異性抗體已經(jīng)完成開發(fā)，生產(chǎn)并交付客戶1.237g抗體。接下來，客戶計(jì)劃采用我們擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的細(xì)胞株進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建，后續(xù)事宜正在商定中。
