使用雜交瘤技術制備非洲豬瘟病毒p72重組蛋白單克隆抗體

發(fā)表時間：2024-01-09

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是一種由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus, ASFV)感染引起的以廣泛性出血為主要癥狀的急性高度接觸性烈性傳染病，發(fā)病率和死亡率高，最急性和急性型感染的死亡率可高達100%，目前尚無用于防治ASF的商業(yè)疫苗或藥物。
p72蛋白是ASFV最外層蛋白質(zhì)外殼的主要組成成分，約占病毒顆粒總質(zhì)量的32%，在病毒感染晚期表達，參與ASFV結合和內(nèi)化入侵宿主細胞、病毒膜運輸和遷移等過程。p72蛋白是檢測病毒時的主要抗原，由于其抗原性穩(wěn)定，常被用于血清學診斷。相對于抗體檢測，抗原檢測可更快速地檢出ASFV，比較常用的方法是雙抗體夾心Elisa法和膠體金免疫層析技術。
以純化的原核表達的p72重組蛋白作為抗原免疫3只Balb/c小鼠，共免疫3次，每次免疫間隔14d。隨后進行小鼠血清抗體效價的檢測，當免疫小鼠血清孔OD450值（P）/陰性小鼠血清孔OD450值(N)≥2.1時，判定所檢測物質(zhì)為陽性。取小鼠脾細胞進行細胞融合及陽性細胞株的篩選，，挑選出5株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞，并將其分泌的單克隆抗體分別進行蛋白免疫印跡（Western Blot，WB）鑒定、免疫熒光鑒定。隨后，鑒定５株雜交瘤細胞的單克隆抗體亞型，選擇其中效價水平較高的３株單克隆抗體進行純化，對小鼠腹腔注射能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞，1×10⁵個/只，以辛酸－硫酸銨法純化腹水中的單克隆抗體，采用微量紫外分光光度計測定濃度，再通過SDS-PAGE鑒定純化與未純化的單克隆抗體純度。

利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)可快速獲得大量重組蛋白，但由于原核表達系統(tǒng)表達的蛋白質(zhì)修飾不完整，天然活性低，而真核表達系統(tǒng)表達的重組蛋白更接近于天然蛋白。這項研究中，在制備p72重組蛋白單克隆抗體時，以大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達的p72重組蛋白作為免疫抗原對小鼠進行免疫，再用真核表達系統(tǒng)表達的p72重組蛋白進行篩選，從而避免了假陽性結果，提高了試驗結果的準確性。
通過重組蛋白表達技術制備ASFV的p72重組蛋白和使用雜交瘤細胞技術制備抗p72蛋白的單克隆抗體，將純化后的單克隆抗體與p72兔源多克隆抗體組合并初步建立用于檢測p72抗原的雙抗體夾心Elisa方法，可以為建立快速、高效、便捷的檢測ASFV的方法提供依據(jù)。
參考文獻：

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