馬(Equus caballus)是一類重要的家畜，在農(nóng)業(yè)畜牧業(yè)、交通運(yùn)輸、體育娛樂等方面發(fā)揮了重要的作用。2020年《世界衛(wèi)生組織疫病感染及侵染名錄》顯示，常見的馬傳染性疾病多達(dá)11種，包括非洲馬瘟(AHS)、馬皰疹病毒-1(EHV-1)感染、馬傳染性貧血(EIA)、馬流行性感冒(EI)等。這些馬傳染性疾病嚴(yán)重影響了馬匹健康，給全球馬產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
在馬的免疫學(xué)研究領(lǐng)域中，由于缺乏一些關(guān)鍵細(xì)胞膜表面蛋白的單克隆抗體，使得相關(guān)研究受到了很大限制。例如，B細(xì)胞主要介導(dǎo)體液免疫，其膜表面表達(dá)特異免疫球蛋白(mIg)，與Igα/Igβ二聚體共同形成B細(xì)胞受體(BCR)復(fù)合物。BCR可以特異性識(shí)別抗原并產(chǎn)生抗體，引起免疫應(yīng)答?；罨?/span>B細(xì)胞可以進(jìn)行親和力成熟和免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換(class switch)，產(chǎn)生記憶B細(xì)胞和可以分泌抗體的漿細(xì)胞，記憶B細(xì)胞再次遇到抗原時(shí)可分化為漿細(xì)胞。第一次遇到抗原時(shí)，表達(dá)IgM和IgD的幼稚B細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生緩慢、低滴度的初級(jí)抗體反應(yīng)，而表達(dá)IgG的記憶B細(xì)胞在二次免疫應(yīng)答時(shí)可以快速產(chǎn)生高滴度的IgG抗體。
1975年K?hler和Milstein首次描述了一種通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體的方法，極大地促進(jìn)了免疫學(xué)的發(fā)展，單克隆抗體成為一種重要的科學(xué)研究工具以及治療分子，該技術(shù)目前仍然是單抗制備的主要技術(shù)，在細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)中發(fā)揮著重要作用。此外，噬菌體展示和酵母展示的方法也被廣泛應(yīng)用于單克隆抗體的生產(chǎn)。近年來，單個(gè)B細(xì)胞抗體篩選技術(shù)逐漸發(fā)展起來，進(jìn)而被應(yīng)用于單克隆抗體的制備，該技術(shù)通過流式細(xì)胞分選的方法，將特異性抗原進(jìn)行熒光標(biāo)記，利用抗原可以特異性結(jié)合B細(xì)胞表面BCR的原理，將單個(gè)目的B細(xì)胞篩選出來，用PCR擴(kuò)增的方法得到抗體的重鏈和輕鏈基因，將抗體基因構(gòu)建在表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中表達(dá)出單克隆抗體(圖1)，該方法省時(shí)高效，且保留了抗體的天然配對(duì)，目前在HIV、COVID-19、流感等傳染性疾病的研究中得到了廣泛應(yīng)用。
單個(gè)B細(xì)胞抗體篩選平臺(tái)技術(shù)路線
Xten? Mab Single B兔單克隆抗體開發(fā)以單個(gè)B細(xì)胞為起始點(diǎn)，利用每個(gè)B細(xì)胞只產(chǎn)生一種特異性抗體的特性，直接從免疫的兔子中通過隨機(jī)分離和抗原特異性分離兩種方式從外周血或淋巴組織中分離單B細(xì)胞，從單個(gè)B細(xì)胞中擴(kuò)增出抗體基因，進(jìn)而獲得抗原特異性抗體。該技術(shù)所制備的抗體具有高通量、高效率、高穩(wěn)定性、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，保留了豐富的基因多樣性和輕重鏈可變區(qū)的天然配對(duì)，應(yīng)用前景廣泛，是最高效的抗體篩選方法之一。特別是在快速應(yīng)對(duì)病原微生物傳染病的抗體開發(fā)上有著巨大優(yōu)勢(shì)。
由于目前市場(chǎng)上并沒有商業(yè)化的馬IgG單克隆抗體，使得對(duì)馬的B細(xì)胞研究受到很大阻礙，因此制備此單克隆抗體是非常有必要的。IgG以膜結(jié)合型(mIgG)表達(dá)于B細(xì)胞表面，是BCR的重要構(gòu)成成分，與B細(xì)胞分化成熟相關(guān)。而IgG1亞型在表達(dá)純化和抗體效應(yīng)功能上均表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，來自暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的研究人員利用單個(gè)B細(xì)胞抗體平臺(tái)成功篩選和鑒定了馬IgG1單克隆抗體，為馬的B細(xì)胞研究提供了重要研究工具。
IgG1-C特異性單克隆抗體的表達(dá)與鑒定
單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)可以直接從免疫后的樣品中擴(kuò)增出單個(gè)B細(xì)胞的抗體基因可變區(qū)，避免了雜交瘤低效的融合步驟，克服了特異性抗體產(chǎn)量低的問題，最大程度的保留了抗體基因庫(kù)的多樣性。
參考文獻(xiàn)
CHEN Yang， LIU Tong， ZHANG Jia-qi， LIAO Hua-xin， LIN Yue-zhi， WANG Xiao-jun， WANG Ya-yu. Screening of Monoclonal Antibodies Targeting the Equine IgG1 Based on Single B Cell Antibodies Gene Amplification Technology. Journal of Chinese Biotechnology， 2022， 42(4): 17-23 doi:10.13523/j.cb.2110009
