嗜肺軍團(tuán)菌（legionella pneumophila
，LP）是一類單極鞭毛革蘭陰性桿菌，能引發(fā)軍團(tuán)病。LP可入侵人肺泡巨噬細(xì)胞，阻礙巨噬細(xì)胞自噬，躲避巨噬細(xì)胞對(duì)其徹底清除，并在巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖，達(dá)到感染宿主的最終目標(biāo)。LP 的脂多糖、菌毛、鞭毛等都與軍團(tuán)菌的致病性相關(guān)，鞭毛蛋白是其重要的毒力因子，可加強(qiáng)病原菌的侵襲。
鞭毛蛋白是 Toll
樣受體 5（TLR5）的特異性配體，TLR5 作為模式識(shí)別受體，在致病菌侵襲宿主時(shí)，TLR5 依靠胞外的 LRR 蛋白結(jié)構(gòu)域（LRR domain）識(shí)別鞭毛蛋白，并觸發(fā)依賴髓樣分化因子 88（MyD88）的信號(hào)通路，激活微管相關(guān)蛋白激酶（microtubule -associated protein kinase，MAPK）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB）誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，有效清除病原體。
來自寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、銀川市第三人民醫(yī)院的研究人員在此前的研究中，使用LP
鞭毛重組蛋白A（rflaA）干預(yù)RAW264.7巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；?/span>6（histone deacetylase 6，HDAC6）增高。HDAC6是一種位于細(xì)胞質(zhì)的去乙?；?，參與多種生物過程的調(diào)控，包括自噬、熱休克反應(yīng)和腫瘤進(jìn)展等。HDAC6還參與了線粒體吞噬和錯(cuò)誤折疊蛋白向溶酶體和蛋白酶體的運(yùn)輸。為了探究HDAC6在rflaA抑制巨噬細(xì)胞自噬中的作用，研究人員選擇 HDAC6-/-C57BL/6J 小鼠巨噬細(xì)胞作為此次實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。
采用支氣管肺泡灌洗法提取C57BL/6J與HDAC6-/-C57BL/6J兩種小鼠巨噬細(xì)胞，用小鼠巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物F4/80鑒定；純化rflaA，CCK-8 法檢測其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50），篩選最佳作用濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；rflaA分別干預(yù)C57BL/6J 及HDAC6-/-C57BL/6J小鼠巨噬細(xì)胞6、12和24 h，RT-qPCR、Western blot 及免疫熒光檢測各組自噬相關(guān)因子自噬效應(yīng)蛋白1（Be－clin1）、自噬相關(guān)蛋白 5（ATG5）、自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈 3（LC3）、SQSTM1 蛋白（P62）的表達(dá)水平。
根據(jù)CCK-8結(jié)果計(jì)算，IC50為0.41 μg·μL-1，最佳作用濃度為0.041 μg·μL-1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；RT-qPCR、Westernblot、免疫熒光結(jié)果顯示，rflaA干預(yù)C57BL/6J小鼠巨噬細(xì)胞后，與0 h相比，6、12、24 h HDAC6的表達(dá)水平升高，LC3、ATG5表達(dá)水平均降低，P62的表達(dá)水平升高，Beclin1的表達(dá)水平先降低后升高（P 均＜0.05）；rflaA干預(yù)HDAC6-/-C57BL/6J小鼠巨噬細(xì)胞后，與0 h 相比，6、12、24 h LC3、ATG5、Beclin1表達(dá)水平均升高，P62的表達(dá)水平降低（P均＜0.05）；在相同的時(shí)間點(diǎn)，與C57BL/6J小鼠巨噬細(xì)胞各組相比，HDAC6敲除后各組細(xì)胞ATG5、LC3 表達(dá)水平升高，Beclin1先升高后降低，P62降低（P均＜0.05）。
小鼠巨噬細(xì)胞免疫熒光鑒定（免疫熒光染色×200）
RT-qPCR
檢測敲除 HDAC6 對(duì) rflaA 干預(yù)小鼠巨噬細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)自噬相關(guān)因子 mRNA 表達(dá)的影響
Western blot
檢測敲除 HDAC6 對(duì) rflaA 干預(yù)小鼠巨噬細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)自噬相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響
LP rflaA干預(yù)C57BL/6J小鼠單核巨噬細(xì)胞后，能抑制其自噬，提示rflaA可能被TLR5識(shí)別，激活炎癥小體使巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)化的LC3脫脂，特異性地阻斷LC3-PE和ATG5相互作用，脫脂后的LC3未與溶酶體融合，從而阻斷自噬體-溶酶體途徑，LC3、ATG5的表達(dá)降低，吞噬體-溶酶體融合受損導(dǎo)致P62積累，積累的P62會(huì)與HDAC6結(jié)合通過泛素結(jié)合區(qū)來維持其去乙?；富钚裕瑢?dǎo)致α-tubulin的去乙?；?，P62通過維持HDAC6活性使微管不穩(wěn)定從而抑制自噬。
隨著時(shí)間發(fā)展，巨噬細(xì)胞的功能逐漸恢復(fù)，rflaA的抑制作用減弱，HDAC6 的活性開始恢復(fù)，表達(dá)水平升高，誘導(dǎo)表達(dá)的Be－clin1表達(dá)水平升高，Beclin1-PIK3C3復(fù)合體形成增多，自噬活性開始逐漸恢復(fù)。
HDAC6作為一種去乙?；?，當(dāng)HDAC6敲除后，rflaA對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的抑制作用降低，巨
噬細(xì)胞乙?；饔迷鰪?qiáng)，微管蛋白穩(wěn)定性增加，微管的運(yùn)輸功能恢復(fù)，有助于恢復(fù)自噬通量，乙?；?/span>P300乙酰化修飾LC3，導(dǎo)致LC3表達(dá)增加。細(xì)胞自噬途徑激活LC3表達(dá)上調(diào)后，自噬誘導(dǎo)Beclin1的乙?；饔迷鰪?qiáng)，Beclin1乙?；軌虼龠M(jìn)自噬體的成熟和降解，自噬小體和自噬溶酶體融合順暢，自噬作用增強(qiáng)，Beclin1表達(dá)升高。而LC3靶向自噬體膜是由ATG5 決定的，ATG5的表達(dá)也相應(yīng)升高。
HDAC6和P62作為泛素結(jié)合蛋白，參與自噬調(diào)控。HDAC6 催化從各種細(xì)胞質(zhì)蛋白中去除乙?；粋€(gè)泛素結(jié)合域，通過此結(jié)合域?qū)㈠e(cuò)誤折疊和損壞的蛋白靶向到自噬小體中。當(dāng)細(xì)胞蛋白質(zhì)被破壞時(shí)，聚集體的形成就會(huì)發(fā)生。聚集體的形成是一種對(duì)錯(cuò)誤折疊損傷蛋白的細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)，并通過自噬誘導(dǎo)其清除。這些蛋白酶體與P62共定位，并通過選擇性巨自噬被清除，所以當(dāng)敲除HDAC6后，為了促進(jìn)泛素聚集體和自噬降解，P62為了招募吞噬體膜上的LC3膜蛋白用于自噬體成熟，而自身被自噬降解，故自噬底物P62減少，P62的表達(dá)下調(diào)。
這充分表明，HDAC6 促進(jìn)rflaA抑制小鼠巨噬細(xì)胞自噬，HDAC6可能通過影響微管蛋白乙?；蓴_巨噬細(xì)胞自噬。這項(xiàng)研究為HDAC6在rflaA干擾巨噬細(xì)胞自噬中的影響提供新的思路，為進(jìn)一步了解HDAC6在LP鞭毛蛋白致病機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)
ZHENG Ronghui,LI Pan,CAO Xiuqin,CHEN Minjia,CHEN Haixia,YANG Zhiwei.HDAC6 Regulates Flagellar Recombinant Protein A Interference Macrophage Autophagy[J].Ningxia Medical University,2023(06):573-580592.doi:10.16050/j.cnki.issn1674-6309.2023.06.006
