蛋白質(zhì)重組表達(dá)通常會融合蛋白或多肽標(biāo)簽以便于重組蛋白的表達(dá),示蹤和純化等,常見標(biāo)簽有His*6,GST,Strep,F(xiàn)c,MBP,F(xiàn)lag和組合式雙標(biāo)簽或多標(biāo)簽。
GST,MBP,F(xiàn)c等蛋白標(biāo)簽由于分子量較大,通常需要酶切去除,以消除其對目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的影響;多肽標(biāo)簽分子量較小,免疫原性較低,基本不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,通??梢圆挥妹盖腥コ?,但用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)或其他較高級研究的蛋白通常也要將小分子量多肽標(biāo)簽酶切去除,以達(dá)到最佳效果。
去除標(biāo)簽的關(guān)鍵在于選擇合適的蛋白酶并構(gòu)建相應(yīng)的氨基酸識別序列。常用的蛋白酶及對應(yīng)的酶切位點(diǎn)如下表:
下面我們對五種常見的蛋白內(nèi)切酶做個簡單介紹
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SUMO protease: 又叫Ulp,是重組表達(dá)的釀酒酵母ULP1(Ubl-specific protease 1)片段,它能夠特異性識別SUMO融合蛋白的空間結(jié)構(gòu)而不是的氨基酸序列。SUMO protease優(yōu)點(diǎn)有:特異性好(無非特異切割),活性高,酶切條件溫和,緩沖液耐受好等特點(diǎn),可以各種常見緩沖液體系中高效切除SUMO融合蛋白。由于SUMO標(biāo)簽具有極佳的促溶和促表達(dá)交效果,SUMO標(biāo)簽與SUMO protease是重組蛋白表達(dá)中最常見融合蛋白標(biāo)簽與蛋白內(nèi)切酶的組合。
推薦指數(shù):★★★★★
圖1. SUMO protease結(jié)合SUMO標(biāo)簽
圖2. SUMO protease切割目標(biāo)蛋白
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HRV 3C Protease:重組表達(dá)的人源3C Protease,是一種半胱氨酸蛋白酶,能特異識別氨基酸序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln↓Gly-Pro,并在谷氨酰胺(Gln)和甘氨酸(Gly)之間切開。普健生物的HRV 3C Protease經(jīng)過嚴(yán)格的測試,具有酶活高,可在不同pH,不同溫度,含咪唑的條件下識別并切割目標(biāo)序列。
推薦指數(shù):★★★★★
圖3. HRV 3C Protease切割目標(biāo)蛋白
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Enterokinase:腸激酶是一種絲氨酸蛋白水解酶,能高效專一地識別蛋白質(zhì)中Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓(DDDDK↓)序列,并在賴氨酸(Lys, K)的C端水解肽鍵。普健生物的重組表達(dá)的腸激酶具有極高的酶切活性。腸激酶的最大優(yōu)勢在于當(dāng)識別序列融合在蛋白標(biāo)簽的C端時,可以達(dá)到酶切后無氨基酸殘留,深受科研工作者喜愛;然而腸激酶的酶切條件要求比較苛刻,需在無鹽離子,室溫或37度溫育時才能發(fā)揮最高活性,對于鹽濃度敏感或溫度敏感的蛋白酶切時容易發(fā)生沉淀。普健生物積累了一套應(yīng)對腸激酶酶切蛋白發(fā)生沉淀的應(yīng)對策略,歡迎大家留言咨詢。
推薦指數(shù):★★★★
圖4. Enterokinase切割目標(biāo)蛋白
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TEV protease:是一種重組表達(dá)的半胱氨酸蛋白酶,能特異性地識別七肽序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly/Ser,并在Gln和Gly/Ser氨基酸殘基之間進(jìn)行酶切。TEV Protease的最佳酶切溫度是30℃,在4℃時也保留了一定的活性,為盡可能保留目標(biāo)蛋白活性,在實(shí)際操作中常用4℃過夜酶切。
推薦指數(shù):★★★★
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Thrombin:凝血酶來源于牛血漿,分子量37 kD,是由兩條肽鏈(31 kD和6 kD)通過二硫鍵組成的。37℃時, 凝血酶活性很高,溫度降低活性也隨之降低,在4℃時基本無酶切活性,所以實(shí)驗(yàn)室使用凝血酶切割目標(biāo)蛋白時常采用室溫酶切或37℃水浴酶切。但熱不穩(wěn)定蛋白在室溫或37℃水浴酶切過程中很有可能會發(fā)生失活或者沉淀,且凝血酶為牛血漿分離提取,純度低,需要用苯甲脒瓊脂糖才能將酶從蛋白樣品中去除,故并不推薦使用。普健生物積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)來解決凝血酶酶切過程中目標(biāo)蛋白受熱沉淀的難題,歡迎大家留言咨詢。
推薦指數(shù):★★
用什么酶可以把抗體切成F(ab)2和Fc?大家第一時間想到的肯定是胃蛋白酶。但是胃蛋白的酶對抗體的切割要在極端的酸性條件下完成,且切割位點(diǎn)并不專一,酶切時間短了,大部分抗體未被切開,酶切時間長了,又會發(fā)生非特異切割。為了切一個抗體,要藥費(fèi)大量時間來摸索酶濃度梯度和酶切時間梯度。我們將推出抗體酶切篇來幫您節(jié)約寶貴時間,輕松搞定抗體酶切,敬請關(guān)注。