生物藥開發(fā)是一個非常復(fù)雜的過程，而構(gòu)建適用于工業(yè)生產(chǎn)的高表達(dá)的細(xì)胞株是第一步也是最關(guān)鍵的步驟之一。CHO細(xì)胞的GS篩選系統(tǒng)是工業(yè)上用得最廣泛的篩選系統(tǒng)。CHO細(xì)胞GS篩選系統(tǒng)主要有以下優(yōu)點(diǎn)：

① CHO細(xì)胞遺傳背景清楚，很少分泌內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的分離純化。

② GS篩選系統(tǒng)產(chǎn)量高，周期快，工業(yè)認(rèn)證度高。

基于豐富的重組表達(dá)抗體生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建經(jīng)驗(yàn)，小普在這里給大家分享一種高效的抗體藥開發(fā)CHO細(xì)胞株構(gòu)建策略。

01

GS篩選系統(tǒng)原理

哺乳細(xì)胞的生長離不開谷氨酰胺，谷氨酰胺合成酶是一種能將谷氨酸和氨合成為谷氨酰胺的酶。這種酶促反應(yīng)是動物細(xì)胞獲得谷氨酰胺的途徑。

CHO細(xì)胞內(nèi)源的谷氨酰胺合成酶活性比較低，無法表達(dá)足夠的谷氨酰胺維持細(xì)胞快速生長，必須在培養(yǎng)基中添加外源的谷氨酰胺。GS抑制劑，L-氨基亞砜蛋氨酸（Methionine Sulphoximine，MSX），可用于抑制內(nèi)源性GS活性，用含目的基因和GS基因標(biāo)記的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主CHO細(xì)胞，通過MSX加壓篩選，促使GS基因和目的蛋白基因擴(kuò)增，只有轉(zhuǎn)染了額外GS基因的細(xì)胞才可以在不含有L-glutamine的培養(yǎng)基中生長，從而篩選獲得重組表達(dá)細(xì)胞株。

02

篩選策略

2.1 宿主細(xì)胞選擇

工業(yè)上主要使用兩大類CHO 細(xì)胞：① GS野生型，含弱的GS活性（GS WT）：CHO-K1（ATCC CCL-61，ECACC 85051005），CHOK1SV（lonza)；② GS缺陷型，敲除GS活性（GS KO）：CHOK1SV-KO（Lonza),CHOZN（Merk）,HD-BIOP3(Horizon)。

使用這些商業(yè)化的細(xì)胞株，需要支付高額的專利費(fèi)用。普健生物憑借近十年的抗體藥物研發(fā)項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，自主開發(fā)了CHO-GS KO細(xì)胞系及GS載體系統(tǒng)，經(jīng)過大量的重組表達(dá)項(xiàng)目驗(yàn)證，產(chǎn)量高達(dá)3g/L以上，穩(wěn)定性好。

2.2 細(xì)胞株篩選方案

① 重組載體構(gòu)建。選擇適合的信號肽，對抗體重輕鏈基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化。將目的基因構(gòu)建到普健專有的GS載體上。

② 轉(zhuǎn)染及Minipools篩選。使用普健生物專利的CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后，加壓篩選Minipools。利用Elisa 或Octet進(jìn)行初篩，選取最優(yōu)的30個minipools，逐級擴(kuò)大培養(yǎng)至TPP搖管中，利用簡單的流加表達(dá)工藝篩選出3株最優(yōu)的minipools。

③ 細(xì)胞株單克隆化。采用特定的有限稀釋方法鋪板，Imager跟蹤成像。利用Elisa或Octet進(jìn)行初篩，選取最優(yōu)的30個monoclones，逐級擴(kuò)大培養(yǎng)至TPP搖管中，利用簡單的流加表達(dá)工藝篩選出10株最優(yōu)的monoclones。將10株最優(yōu)的monoclones傳至搖瓶中，利用特定的搖瓶工藝對10株monoclones 進(jìn)行細(xì)胞生長特性，代謝特性，產(chǎn)量，抗體糖基化修飾，抗體聚體等質(zhì)量分析，綜合篩選出最優(yōu)的3株生產(chǎn)用細(xì)胞株。

④ 個性化產(chǎn)量優(yōu)化和糖型調(diào)節(jié)。普健生物有多種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，補(bǔ)料培養(yǎng)基及流加表達(dá)培養(yǎng)方案。可以根據(jù)不同的細(xì)胞株生長特性， 篩選出最優(yōu)的流加表達(dá)工藝。同時，也可以用特定的調(diào)糖培養(yǎng)基調(diào)節(jié)不同的糖型的比例。

⑤ 完善的抗體質(zhì)量評估系統(tǒng)。主要包括抗體效價，活性分析；抗體聚體分析；抗體糖基化分析；抗體效能分析等。

⑥ 生產(chǎn)細(xì)胞株穩(wěn)定性分析。包括基因型穩(wěn)定性分析及30個代次的傳代穩(wěn)定性分析。

03

案例展示

圖1 單克隆產(chǎn)量分析

圖2 流加表達(dá)測試產(chǎn)量優(yōu)化

圖3 抗體聚體分析（SEC-HPLC）

圖4 抗體親和力分析（Biocore）

圖5 細(xì)胞株穩(wěn)定性分析圖

04

穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)

高效的CHO穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建體系，需要從上游的雜交瘤抗體測序，到序列優(yōu)化，人源化，再到細(xì)胞株構(gòu)建，個性化細(xì)胞株優(yōu)化及質(zhì)控檢測，整個技術(shù)體系成熟，儀器配備齊全，能夠快速助力抗體藥的臨床前研究。CHO-GS KO細(xì)胞系及GS載體系統(tǒng)，抗體表達(dá)產(chǎn)量>3g/L以上。CHO細(xì)胞專利轉(zhuǎn)染技術(shù)，及提高抗體產(chǎn)量的穩(wěn)定細(xì)胞株篩選技術(shù)。完善的抗體質(zhì)量分析平臺，可以提供Elisa、FACS、還原/非還原SDS-PAGE、SDS-CE、SEC-HPLC、LC-MS、ADCC和Biacore等分析。

優(yōu)勢

高質(zhì)：外源基因嚴(yán)格鑒定，細(xì)胞來源清晰，無污染。

高產(chǎn)：重組蛋白/抗體表達(dá)量可快速優(yōu)化至2g/L以上穩(wěn)定表達(dá)。

穩(wěn)定：獨(dú)有的GS穩(wěn)轉(zhuǎn)系列載體配合MSX藥物篩選，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定傳代15-30代以上。

快速：篩選高產(chǎn)細(xì)胞株，周期短至3個月。

靈活定制：可針對重組蛋白/抗體全長或片段進(jìn)行個性化表達(dá)。

經(jīng)驗(yàn)豐富：專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)，已成功為國內(nèi)外多家醫(yī)藥公司和研究單位構(gòu)建交付穩(wěn)定細(xì)胞株。

多篩選系統(tǒng)：G418/潮霉素/嘌呤霉素篩選系統(tǒng)，GS/DHFR 篩選系統(tǒng)等。