隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,全球化資源整合為生物制藥行業(yè)提供了越來(lái)越全面的技術(shù)支撐,抗體藥物的發(fā)展也獲得越來(lái)越多的重視?？贵w藥物開(kāi)發(fā)是一個(gè)非常繁雜的過(guò)程,而穩(wěn)定細(xì)胞株適用于抗體藥開(kāi)發(fā)的各個(gè)階段,如重組蛋白和抗體生產(chǎn)、檢測(cè)分析、功能性研究等等。構(gòu)建適用于工業(yè)生產(chǎn)的高表達(dá)細(xì)胞株是第一步也是關(guān)鍵步驟之一。

在重組蛋白表達(dá)、抗體生產(chǎn)及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建等方面有著10余年經(jīng)驗(yàn)。今天小普與大家分享一種基于CHO細(xì)胞株構(gòu)建的高效抗體藥開(kāi)發(fā)策略,能顯著提高細(xì)胞株開(kāi)發(fā)效率,實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的細(xì)胞株開(kāi)發(fā)。

CHO表達(dá)系統(tǒng)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞是用于生產(chǎn)單抗在內(nèi)的商業(yè)化治療性蛋白產(chǎn)品的主要宿主細(xì)胞。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞是生產(chǎn)蛋白類(lèi)藥物的首選宿主細(xì)胞,因?yàn)榕c其他系統(tǒng)相比,CHO細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn)：

①CHO 細(xì)胞對(duì)蛋白有準(zhǔn)確的加工、修飾功能,因此其表達(dá)的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性更接近于天然蛋白；

②CHO 細(xì)胞耐受剪切力和滲透壓的能力相對(duì)較強(qiáng),可根據(jù)培養(yǎng)要求選擇貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的方式；

③整合外源基因后的細(xì)胞穩(wěn)定,重組基因能高效擴(kuò)增和表達(dá)；

④表達(dá)目的蛋白可由細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外,并且CHO 細(xì)胞只表達(dá)少量的內(nèi)源蛋白,有利于目的蛋白的提取。

GS篩選系統(tǒng)原理

哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程需要谷氨酰胺（L-glutamine），谷氨酰胺合成酶（GS)將谷氨酸和氨轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，哺乳動(dòng)物細(xì)胞通過(guò)這一酶促反應(yīng)獲得谷氨酰胺。

CHO細(xì)胞內(nèi)源的谷氨酰胺合成酶活性比較低,需要在培養(yǎng)基中額外添加外源谷氨酰胺才能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。利用GS抑制劑,L-氨基亞砜蛋氨酸(Methionine Sulphoximine，MSX)抑制內(nèi)源性GS活性，用含目的基因和GS基因標(biāo)記的表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染宿主CHO細(xì)胞,通過(guò)MSX加壓篩選，促使GS基因和目的蛋白基因擴(kuò)增,只有轉(zhuǎn)染了額外GS基因的細(xì)胞才可以在不含有谷氨酰胺（L-glutamine）的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),從而篩選獲得重組表達(dá)細(xì)胞株。

篩選策略01宿主細(xì)胞選擇

工業(yè)上主要使用兩大類(lèi)CHO細(xì)胞：

①GS野生型,含弱的GS活性(GS WT):CHO-K1(ATCC CCL-61,ECACC 85051005)，CHOK1SV(lonza);

②GS缺陷型,敲除GS活性(GS KO):CHOK1SV-KO(Lonza),CHOZN(Merk),HD-BIOP3(Horizon)。

02細(xì)胞株篩選

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是將外源分子(如DNA,RNA)導(dǎo)入真核細(xì)胞，細(xì)胞株篩選方案包括一系列步驟：

01
重組載體構(gòu)建

選擇適合的信號(hào)肽，對(duì)抗體重輕鏈基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化。將目的基因構(gòu)建到普健專(zhuān)有的GS載體上。

02轉(zhuǎn)染及Minipools篩選

使用普健生物專(zhuān)利的CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后,加壓篩選Minipools。利用ELISA或Octet進(jìn)行初篩，選取最優(yōu)的30個(gè)minipools,逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)至TPP搖管中,利用簡(jiǎn)單的流加表達(dá)工藝篩選出3個(gè)最優(yōu)的minipools。

03細(xì)胞株單克隆化

采用特定的有限稀釋方法鋪板,Imager跟蹤成像。利用ELISA或Octet進(jìn)行初篩，選取最優(yōu)的30個(gè)單克隆,逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)至TPP搖管中，利用簡(jiǎn)單的流加表達(dá)工藝篩選出10株最優(yōu)的單克隆。將10株最優(yōu)的單克隆傳至搖瓶中,利用特定的搖瓶工藝對(duì)10株單克隆進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)特性,代謝特性,產(chǎn)量,抗體糖基化修飾,抗體聚體等質(zhì)量分析，綜合篩選出最優(yōu)的3株生產(chǎn)用細(xì)胞株。

04個(gè)性化產(chǎn)量?jī)?yōu)化和糖型調(diào)節(jié)

普健生物有多種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，補(bǔ)料培養(yǎng)基及流加表達(dá)培養(yǎng)方案。可以根據(jù)不同的細(xì)胞株生長(zhǎng)特性,篩選出最優(yōu)的流加表達(dá)工藝。同時(shí),也可以用特定的調(diào)糖培養(yǎng)基調(diào)節(jié)不同的糖型的比例。

05完善的抗體質(zhì)量評(píng)估系統(tǒng)

主要包括:抗體效價(jià)、活性分析,抗體聚體分析,抗體糖基化分析,抗體效能分析等。

06生產(chǎn)細(xì)胞株穩(wěn)定性分析

包括基因型穩(wěn)定性分析及30個(gè)代次的傳代穩(wěn)定性分析。

案例展示

構(gòu)建生產(chǎn)重組抗體的CHO穩(wěn)定細(xì)胞株。

Fig.1 單克隆產(chǎn)量分析

Fig.2 流加表達(dá)測(cè)試產(chǎn)量?jī)?yōu)化

Fig.3 抗體聚體分析（SEC-HPLC）

Fig.4 抗體親和力分析（Biacore）

Fig.5 細(xì)胞株穩(wěn)定性分析圖

XtenCHO^TM高密度表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑、表達(dá)培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基相較于常用的陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、商業(yè)化CHO培養(yǎng)基以及補(bǔ)料培養(yǎng)基,成本大大降低,更適用于工業(yè)生產(chǎn),在規(guī)模較大的重組蛋白瞬時(shí)表達(dá)生產(chǎn)中更能體現(xiàn)其性?xún)r(jià)比高的特點(diǎn)。

普健生物穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)

擁有高效的，從上游的雜交瘤抗體測(cè)序，到序列優(yōu)化，人源化，再到細(xì)胞株構(gòu)建，個(gè)性化細(xì)胞株優(yōu)化及質(zhì)控檢測(cè)，整個(gè)技術(shù)體系成熟，儀器配備齊全，能夠快速助力抗體藥的臨床前研究。普健生物憑借十余年的抗體藥物研發(fā)項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，自主開(kāi)發(fā)了CHO-GS KO細(xì)胞系及GS載體系統(tǒng)，抗體表達(dá)產(chǎn)量>3g/L以上。自主研發(fā)了CHO細(xì)胞專(zhuān)利轉(zhuǎn)染技術(shù)，及提高抗體產(chǎn)量的穩(wěn)定細(xì)胞株篩選技術(shù)。擁有完善的抗體質(zhì)量分析平臺(tái)，可以提供ELISA、FACS、還原/非還原SDS-PAGE、SDS-CE、SEC-HPLC、LC-MS、ADCC和Biacore等分析。

服務(wù)流程

服務(wù)優(yōu)勢(shì)
高質(zhì)：外源基因嚴(yán)格鑒定，細(xì)胞來(lái)源清晰，無(wú)污染。

高產(chǎn)：重組蛋白/抗體表達(dá)量可快速優(yōu)化至2g/L以上穩(wěn)定表達(dá)。

穩(wěn)定：獨(dú)有的GS穩(wěn)轉(zhuǎn)系列載體配合MSX藥物篩選，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定傳代15-30代以上。

快速：篩選高產(chǎn)細(xì)胞株，周期短至3個(gè)月。

靈活定制：可針對(duì)重組蛋白/抗體全長(zhǎng)或片段進(jìn)行個(gè)性化表達(dá)。

經(jīng)驗(yàn)豐富：專(zhuān)業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)，已成功為國(guó)內(nèi)外多家醫(yī)藥公司和研究單位構(gòu)建交付穩(wěn)定細(xì)胞株。

多篩選系統(tǒng)：G418/潮霉素/嘌呤霉素篩選系統(tǒng)，GS/DHFR 篩選系統(tǒng)等。