大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)
雖然目前應(yīng)用最為廣泛，
但在需要可溶性蛋白時，
得到的卻有可能是包涵體。
或許，
我們可以先了解一下包涵體到底是啥

↓
包涵體(Inclusion Body)是外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時，尤其是在大腸桿菌中高效表達(dá)時，形成的由膜包裹的高密度（1.3 mg/ml）不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時為高折射區(qū)，與胞質(zhì)中其他成分有明顯區(qū)別。

▲
包涵體示意圖

包涵體一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白以及脂體、脂多糖等，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。

包涵體大小為0.5-1 um左右，大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中的包涵體直徑一般在0.2 μm到1.5 μm之間。不同的蛋白質(zhì)具有不同的直徑，如干擾素的大小是0.811 μm，而牛凝乳酶原的大小是1.281 μm。在一些情況下，有些包涵體比較大，直徑大于大腸桿菌的直徑，使得大腸桿菌有一個突起。大的包涵體可以利用光學(xué)顯微鏡看到。一般情況下，一個細(xì)胞僅有一個包涵體。包涵體從來不吸附在膜上，并且不同于真核細(xì)胞中的其他細(xì)胞器。高精度的投射電子顯微鏡顯示了低分子量包涵體的多孔結(jié)構(gòu)。

還有一種叫做
↓病毒包涵體

病毒在增殖的過程中，常使寄主細(xì)胞形成一種蛋白質(zhì)性質(zhì)的病變結(jié)構(gòu)，在光學(xué)顯微鏡下可見，多為圓形、卵圓形或不定形。一般是由完整的病毒顆?；蛏形囱b配的病毒亞基聚集而成，少數(shù)則是宿主細(xì)胞對病毒感染的反應(yīng)產(chǎn)物，不含病毒粒子。有的位于細(xì)胞質(zhì)中（如天花病毒包涵體），有的位于細(xì)胞核中（如皰疹病毒），或細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中都有（如麻疹病毒）。有的還具有特殊名稱，如天花病毒包涵體叫顧氏（Guarnieri）小體，狂犬病毒包涵體叫內(nèi)基氏（Negri）小體。細(xì)胞中的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)常以可溶性或分子復(fù)合物的形式存在，功能性的蛋白質(zhì)總是折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)型。而包涵體內(nèi)的蛋白是非折疊狀態(tài)的聚集體，因此不具有生物學(xué)活性。

↑
這也是包涵體讓人頭疼的原因。

那么，
它是怎樣形成的呢？
↓ 包涵體形成的原因 

包涵體之所以形成可能與重組蛋白在表達(dá)過程中缺乏某些折疊輔助因子或環(huán)境不適無法形成正確的次級鍵有關(guān)。
01表達(dá)量過高
研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體?？赡苁呛铣伤俣忍煲灾劣跊]有足夠的時間進(jìn)行蛋白折疊，二硫鍵不能正確配對，過多蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。
02氨基酸組成
一般含半胱氨酸越多的重組蛋白越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。
03所處的環(huán)境
發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。
04蛋白的來源

重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物蛋白翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。因此有人采用共表達(dá)分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。

05包涵體形成的位置 
蛋白包涵體是一個廣泛存在的現(xiàn)象，在大腸桿菌中，包涵體可在細(xì)胞的兩個位置出現(xiàn)：細(xì)胞質(zhì)和外周胞質(zhì)。通常認(rèn)為蛋白的聚集無論出現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外，都是由于中間體不能完成折疊導(dǎo)致的。

包涵體在細(xì)胞內(nèi)形成的位置和特點
取決于蛋白表達(dá)的方式。
當(dāng)大量表達(dá)時，三種不同的（天然的、含有OmpA信號肽的和完全切除天然信號肽的）內(nèi)酰氨酶都形成了包涵體，但前兩者的包涵體在外周胞質(zhì)，后者卻在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。這些包涵體的大小和形狀有相當(dāng)清楚的差別，這些差別表現(xiàn)在包涵體的表面形態(tài)、組成和多肽鏈構(gòu)象上。

  包涵體的純化 
包涵體的純化主要有以下幾個步驟：
1
收菌破碎
細(xì)菌發(fā)酵液高速離心收集菌體，經(jīng)超聲破碎或者裂解液處理后，高速離心收集沉淀。
2洗滌
用低濃度的變性劑如2 M尿素在50 mM Tris ，pH 7.5條件下洗滌包涵體，除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。該步驟一定要作用溫和，過高濃度的尿素或鹽酸胍會使包涵體溶解而無法粗純將雜質(zhì)分離。
3
變性溶解
一般用強(qiáng)的變性劑如尿素、鹽酸胍，通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展。通常而言鹽酸胍優(yōu)于尿素，兩者比較如下所示：
 優(yōu)點
 尿素（8 M-10 M）：尿素溶解不電離，呈中性，成本低，蛋白復(fù)性后除去不會造成大量蛋白沉淀；溶解后的包涵體可選用多種色譜方法純化。
鹽酸胍（6 M-8 M）：溶解能力強(qiáng)，高達(dá)95%以上，溶解作用快而不造成重組蛋白的共價修飾。
 缺點 
尿素（8M-10M）：較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70%-90%。
鹽酸胍（6M-8M）：成本高，酸性條件下易形成沉淀，復(fù)性后除去可能造成蛋白大量沉淀；對蛋白離子交換色譜有干擾。
  包涵體的復(fù)性

 由于包涵體中的重組蛋白缺乏生物學(xué)活性，加上劇烈的處理條件，使蛋白的高級結(jié)構(gòu)破壞，因此重組蛋白的復(fù)性特別重要。通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時復(fù)性過程開始，到2M左右時結(jié)束。對于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M 時復(fù)性過程結(jié)束。

復(fù)性是一個非常復(fù)雜的過程，除與蛋白復(fù)性的過程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白本身的性質(zhì)有關(guān)：有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰RNA酶有12對二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到95%以上，而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法，如IL-11。很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之零點幾。一般來說，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。影響復(fù)性效率的因素有蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢、離子強(qiáng)度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。常用的復(fù)性方法有以下幾種。

 稀釋復(fù)性 

用復(fù)性緩沖液快速稀釋溶解的包涵體蛋白溶液，降低變性劑濃度簡單地使去折疊的蛋白進(jìn)行再折疊。優(yōu)點：操作簡單。
缺點：慢，體積增加很大，變性劑稀釋速度太快不易控制，蛋白會被稀釋到很低濃度。 

透析復(fù)性 

通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑的去除速度達(dá)到使包涵體復(fù)性的目的。
優(yōu)點：操作簡單，不增加體積。
缺點：慢，使用大量的緩沖液，不適合大規(guī)模大批量的復(fù)性操作。

 凝膠過濾層析 

利用分子篩效應(yīng)將蛋白質(zhì)和小分子變性劑分離，實現(xiàn)溶液交換和蛋白質(zhì)的再折疊。優(yōu)點：一步操作，直接自動化完成蛋白復(fù)性和純化，簡單快捷。
缺點：樣品體積受限制，若復(fù)性失敗則預(yù)裝柱會被堵死廢棄。 

離子交換層析

 減少導(dǎo)致蛋白聚集的分子間相互作用，將蛋白質(zhì)結(jié)合在分離介質(zhì)上從而達(dá)到使溶液中變性劑濃度稀釋和蛋白質(zhì)純化的目的。
優(yōu)點：快速并簡單，直接進(jìn)行，操作自動化。
缺點：操作應(yīng)避免使用與離子交換相反電荷的物質(zhì)。

  復(fù)性效率的檢測 

根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行檢測。主要的檢測方法有以下幾種：
01凝膠電泳
一般用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對情況。
02光譜學(xué)方法
可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測，但一般只用于復(fù)性研究中的過程檢測。
03色譜方法
如IEX、RP-HPLC、CE等，因為兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同。
04生物學(xué)活性及比活測定
一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測定，較好地反映了復(fù)性蛋白的活性。值得注意的是，不同的測活方法測得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。
05黏度和濁度測定
復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。
06免疫學(xué)方法
如ELISA、Western等，特別是對結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗，比較真實地反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。

雖然我們都不怎么喜歡包涵體，
但它也不是一無是處
↓ 包涵體也有優(yōu)越性 
在下游生產(chǎn)過程中特別是在醫(yī)藥生產(chǎn)中，以包涵體形式表達(dá)的蛋白具有一些優(yōu)越性。
 01 異源表達(dá)的蛋白很容易被宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶降解，如果以包涵體形式表達(dá)，由于酶攻擊的位點被包埋了，可最大限度地抵抗蛋白酶的攻擊。
 02 由于包涵體表達(dá)的蛋白沒有活性，細(xì)胞破碎和后續(xù)的純化步驟不用考慮蛋白的失活問題。
 03 包涵體蛋白與宿主細(xì)胞其他蛋白的分離比可溶蛋白的分離方法簡便且造價低，使用簡單的離心或過濾的手段就能使包涵體與宿主細(xì)胞的其他蛋白成分有效分離。
 04 有些外源蛋白對細(xì)胞有毒或能致死，大量表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，使最終的細(xì)胞數(shù)量和產(chǎn)物相當(dāng)?shù)?，而包涵體形式的蛋白質(zhì)由于喪失了生物活性從而可以高效大量地表達(dá)。
 05 對于以包涵體形式表達(dá)的產(chǎn)物比較容易進(jìn)行在線觀測定性，含有包涵體蛋白質(zhì)的細(xì)胞有較大的折射率，不必像可溶的蛋白質(zhì)需要細(xì)胞破碎后使用酶學(xué)或者電泳學(xué)的方法進(jìn)行鑒定。  最后 
Renaturation is an art form and no standard protocol exists。

相信隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)工程學(xué)及相關(guān)新技術(shù)和新設(shè)備的發(fā)展和完善，在不久的將來，預(yù)測和設(shè)計最佳復(fù)性方案將成為可能。