IHC

是免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry）的簡(jiǎn)稱，是以免疫學(xué)的抗原-抗體反應(yīng)為理論基礎(chǔ)，用標(biāo)記的特異性抗體（抗原），對(duì)組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（抗體）進(jìn)行定位、定性和半定量檢測(cè)，經(jīng)組織化學(xué)顯色反應(yīng)，利用光鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察的一項(xiàng)技術(shù)。若該技術(shù)主要用于研究和觀察細(xì)胞內(nèi)的某些成分，又可稱為ICC，即免疫細(xì)胞化學(xué)（Immunocytochemistry）。

研究對(duì)象

所有能作為抗原或者半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖以及病原體等，都可以成為它的研究對(duì)象。

其優(yōu)勢(shì)在于特異性高，敏感性高，方法步驟統(tǒng)一，形態(tài)、功能和代謝密切結(jié)合等方面。因此，IHC/ICC已成為臨床病理不可或缺的輔助手段，尤其是根據(jù)該技術(shù)檢測(cè)結(jié)果的表達(dá)水平所發(fā)展起來(lái)的相關(guān)“個(gè)體化治療”方案，使免疫組化的質(zhì)量及質(zhì)控管理愈來(lái)愈受到高度重視。

IHC/ICC主要有四種基本類型

1

傳統(tǒng)直接法新型直接法

原理

傳統(tǒng)直接法將已知的特異性抗體與標(biāo)記物結(jié)合，制備成標(biāo)記抗體，再用標(biāo)記抗體直接與標(biāo)本內(nèi)的相應(yīng)抗原結(jié)合，光鏡下觀察抗原存在部位呈現(xiàn)特異性標(biāo)記。

新型直接法采用一種具有惰性的多聚化合物（葡聚糖）為骨架，將特異性抗體和HRP結(jié)合在骨架上，形成HRP-葡聚糖-特異性抗體的巨大復(fù)合物，其內(nèi)的特異性抗體直接與標(biāo)本內(nèi)的相應(yīng)抗原結(jié)合，經(jīng)酶促反應(yīng)，即可在光鏡下觀察特異性陽(yáng)性結(jié)果，也叫多聚螯合物酶法——EPOS法（Enhanced Polymer One-step Stainning）。

優(yōu)點(diǎn)

傳統(tǒng)直接法特異性強(qiáng)，非特異性反應(yīng)較少，技術(shù)操作簡(jiǎn)便。

新型直接法敏感性極強(qiáng)，背景無(wú)染色，大大縮短了試驗(yàn)時(shí)間，是目前最簡(jiǎn)便的免疫組織化學(xué)方法，用于冰凍切片作用尤為突出。

缺點(diǎn)

傳統(tǒng)直接法必須標(biāo)記每一種特異性抗體，且只能檢測(cè)一種抗原，敏感性較差，同時(shí)反應(yīng)的信號(hào)也較小，特別是對(duì)于組織或細(xì)胞內(nèi)微量的抗原檢測(cè)。

新型直接法商品化的EPOS品種不多，試劑價(jià)格較昂貴。

2

傳統(tǒng)間接法新型間接法

原理

傳統(tǒng)間接法是用未標(biāo)記的一抗與標(biāo)本內(nèi)的相應(yīng)的抗原物質(zhì)結(jié)合，用標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，或經(jīng)過(guò)酶促反應(yīng)后利用光鏡觀察有色的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物。

新型間接法是將標(biāo)本內(nèi)的抗原與一抗結(jié)合后，標(biāo)記有多聚化合物酶復(fù)合物的二抗與一抗結(jié)合，經(jīng)酶促反應(yīng)進(jìn)行顯色定位，也叫EnVision法。

注：EnVision復(fù)合物是由二抗分子的一個(gè)Fab段與HRP/ALP通過(guò)聚合技術(shù)結(jié)合在線狀的葡聚糖上而形成。

優(yōu)點(diǎn)

傳統(tǒng)間接法一個(gè)一抗可以結(jié)合多個(gè)二抗抗體分子，增強(qiáng)了免疫反應(yīng)信號(hào)，敏感性比直接法增大3-4倍；一抗使用濃度較直接法低；不用直接標(biāo)記一抗，標(biāo)記的二抗可以用于多種一抗。

新型間接法每一分子的EnVision復(fù)合物中約含有70個(gè)酶分子和10個(gè)二抗分子，具有高度的方法作用，也增加了與一抗分子的結(jié)合機(jī)會(huì)；機(jī)體內(nèi)不存在這種葡聚物，背景非常干凈；染色步驟分為兩步，操作簡(jiǎn)便省時(shí)。

缺點(diǎn)

傳統(tǒng)間接法特異性低于直接法，容易出現(xiàn)非特異性染色；染色步驟較多，染色所需時(shí)間延長(zhǎng)。

新型間接法是目前最優(yōu)化的方法。

3

酶橋法PAP法

原理

酶橋法是制備同種屬的特異性一抗和抗酶抗體（三抗），利用二抗作為橋梁將三抗與一抗連接起來(lái)，三抗的標(biāo)記酶經(jīng)酶促反應(yīng)，即可在抗原位置上呈現(xiàn)有色陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物。

PAP法則是借助二抗的橋梁作用，將PAP/ALP復(fù)合物連接在與組織抗原結(jié)合的一抗上。PAP復(fù)合物由3分子酶和2分子的抗酶抗體構(gòu)成，抗酶抗體和一抗為同種屬動(dòng)物的IgG，經(jīng)相應(yīng)的酶促反應(yīng)，可通過(guò)顯微鏡觀察到陽(yáng)性結(jié)果。

優(yōu)點(diǎn)

酶橋法3種抗體均被酶標(biāo)記，酶是通過(guò)免疫學(xué)原理被標(biāo)記在三抗上，避免了因化學(xué)方式結(jié)合對(duì)抗體和酶活性的損害，提高了方法的敏感性，節(jié)省了一抗的用量。

PAP法抗體活性高，靈敏度高，背景染色低。

缺點(diǎn)

酶橋法標(biāo)記的酶類很難被精確的稀釋到恰當(dāng)?shù)臐舛?，以達(dá)到和三抗的抗酶部位全部結(jié)合，同時(shí)也難以徹底洗脫掉與標(biāo)本中其他成分非特異性結(jié)合的酶，造成較高的非特異性染色。

PAP法染色步驟較多，需要的染色時(shí)間長(zhǎng)。

4

ABC法SP法

原理

ABC法即抗生物素-生物素-過(guò)氧化物酶法，它的關(guān)鍵是ABC復(fù)合物，由一個(gè)卵白素分子結(jié)合3個(gè)生物素化的過(guò)氧化物酶分子構(gòu)成。卵白素作為“橋”連接在生物素標(biāo)記的過(guò)氧化物酶與生物素標(biāo)記的抗體之間，于是形成一個(gè)含有3個(gè)以上過(guò)氧化物酶分子的網(wǎng)格狀復(fù)合物，通過(guò)ABC復(fù)合物中卵白素與生物素化抗體結(jié)合，經(jīng)過(guò)組織化學(xué)的酶顯色反應(yīng)，達(dá)到檢測(cè)組織或細(xì)胞原位內(nèi)抗原的目的。

SP法即鏈霉抗生物素-生物素法，與ABC法相似，不同的是鏈霉抗生物素蛋白與生物素化酶（HRP）結(jié)合，形成鏈霉抗生物素-生物素化酶復(fù)合物，這種復(fù)合物再與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，通過(guò)酶的顯色反應(yīng)檢測(cè)抗原存在的部位。

優(yōu)點(diǎn)

ABC法敏感性高（相對(duì)于PAP法），特異性強(qiáng)，尤其適用于單克隆抗體，組織背景染色淺，操作方法簡(jiǎn)便，節(jié)省染色時(shí)間。

SP法相比ABC法，有效地降低了內(nèi)源性生物素帶來(lái)的非特異性反應(yīng)的程度，敏感性增加了4-8倍。

缺點(diǎn)

ABC法使用時(shí)某些器官或者組織內(nèi)的內(nèi)源性生物素與卵白素特異性結(jié)合，引起非特異性反應(yīng)增強(qiáng)。

隨著免疫組織化學(xué)各項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，相繼建立了多種不同的標(biāo)記抗體的方法，因而也就產(chǎn)生了與其相應(yīng)的各種免疫組織（細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)。根據(jù)標(biāo)記物的不同，可以分為：免疫熒光組織（細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)、免疫酶組織（細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)、免疫鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)、免疫金銀標(biāo)記技術(shù)、親和免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫電子顯微鏡技術(shù)、雜交免疫組織（細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)、免疫雙重和多重組織（細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)。

以上都是理論，

來(lái)看一點(diǎn)實(shí)際的。

操作流程

現(xiàn)從取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色和封固這9個(gè)過(guò)程詳盡的介紹最常用的石蠟切片免疫組織化學(xué)技術(shù)。

標(biāo)本取材

很重要！

取材是標(biāo)本制備過(guò)程的第一步，取材是否科學(xué)，是否符合實(shí)驗(yàn)要求，將直接影響光鏡下組織或細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察。

怎么做？

不論取材的標(biāo)本來(lái)自何種途徑，首先應(yīng)盡量保證所取材標(biāo)本的形態(tài)完整性和材料新鮮性。

為什么？

因?yàn)樗劳鰞尚r(shí)以上的標(biāo)本，其組織或細(xì)胞將呈現(xiàn)出不同程度的自溶，有些抗原可能會(huì)出現(xiàn)變形、彌散和消失的現(xiàn)象。這些都不利于抗原抗體的結(jié)合，從而直接地影響免疫組織化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差。因此，取材要求準(zhǔn)確、迅速和完整，以免因操作不當(dāng)造成抗原破壞或丟失，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。

舉三個(gè)例子

活檢標(biāo)本/病理標(biāo)本

對(duì)于病變部位大的標(biāo)本，取材要具有代表性，在保證組織結(jié)構(gòu)完整的情況下，可適當(dāng)分割成為較薄的標(biāo)本塊，其中應(yīng)包括：主要病灶、病灶與正常組織交界處、病灶周圍的正常組織。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵筮x擇正確的動(dòng)物麻醉方法或者處死方法進(jìn)行取材。

細(xì)胞標(biāo)本

不論是獲取的新鮮細(xì)胞液，還是經(jīng)過(guò)酶消化作用而制備成的細(xì)胞懸浮，都可以通過(guò)離心沉淀的方法使細(xì)胞濃縮成細(xì)胞團(tuán)，吸出上清液。注意緩慢加入固定劑，不要將細(xì)胞團(tuán)沖散。固定時(shí)間一般為1-6小時(shí)。

標(biāo)本固定

用于標(biāo)本固定的固定劑種類很多，不同的固定劑固定的標(biāo)本適用于不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?yīng)根據(jù)檢測(cè)物質(zhì)的抗原性質(zhì)、所使用的抗體特征以及固定劑的性質(zhì)選擇合適的固定劑。目前用于免疫組化實(shí)驗(yàn)的常用固定劑有以下幾種。

10% 福爾馬林緩沖液（pH 7.4）

配制方法

10%甲醛溶液加入0.01 mol/L pH 7.4 PBS緩沖液90 mL，混合均勻，即為10%福爾馬林緩沖液。

適用范圍

該固定液廣泛適用于標(biāo)本的固定，既能有效的保護(hù)標(biāo)本的組織或細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，又能保持標(biāo)本內(nèi)的抗原活性，只是甲醛的交聯(lián)作用會(huì)對(duì)某些抗原表面的抗原決定簇有一定的封閉作用，因此要在染色前對(duì)封閉的抗原決定簇進(jìn)行暴漏，即抗原修復(fù)。常規(guī)大小的標(biāo)本塊，固定時(shí)間為12-24小時(shí)。

4% 多聚甲醛緩沖液（pH 7.4）

配制方法

多聚甲醛40 g溶于0.01 mol/L pH 7.4 PBS緩沖液500 mL，攪拌加熱至60℃，滴加1 mol/L氫氧化鈉至溶液清澈，冷卻至室溫，最后補(bǔ)加PBS達(dá)總體積為1000 mL，過(guò)濾，即為4%多聚甲醛緩沖液，4℃冰箱保存。

適用范圍

它對(duì)標(biāo)本的滲透性較強(qiáng)且產(chǎn)生的收縮小，由于其pH近中性，可以最大限度的保存抗原的活性，由于該固定劑性質(zhì)較為溫和，于4℃保存較長(zhǎng)時(shí)間的標(biāo)本，仍可獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)也適用于標(biāo)本灌注固定，灌注后的標(biāo)本再在此固定劑中浸泡固定6-12小時(shí)即可。

Bouin固定劑

配制方法

在75 mL的飽和的苦味酸溶液中加入25 mL 10%甲醛溶液，再加入5 mL冰醋酸，混合后即為Bouin液。

適用范圍

它也是形態(tài)學(xué)常用的固定劑，對(duì)于某些抗原的保存較10%福爾馬林緩沖液更適合免疫細(xì)胞化學(xué)的研究。對(duì)標(biāo)本的滲透性強(qiáng)，產(chǎn)生的收縮少，但其pH為3-3.5，對(duì)標(biāo)本內(nèi)的抗原可能有一定的損壞，因此標(biāo)本不適合在固定劑中長(zhǎng)期停留。

標(biāo)本處理

脫水

透明

浸蠟

包埋

切片

詳細(xì)步驟如下圖所示

↓

最后兩步

染色和封固

常用染色方法步驟

脫蠟：二甲苯，室溫，兩次，每次20分鐘。

↓

水合 ：100%→100%→95%→90%→80%→70%乙醇→蒸餾水，每級(jí)5分鐘。

↓

3%過(guò)氧化氫，室溫孵育10分鐘。蒸餾水沖洗。PBS浸洗5分鐘。

↓

抗原修復(fù)。

↓

PBS洗滌3分鐘，3次。

↓

封閉用血清，室溫孵育10-30分鐘，傾去血清，勿洗。

↓

滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育60-90分鐘，或者4℃過(guò)夜。

↓

PBS洗滌3分鐘，3次。

↓

生物素標(biāo)記的二抗，室溫30分鐘。

↓

PBS洗滌3分鐘，3次。

↓

ABC復(fù)合物，室溫孵育30-60分鐘。（ABC法）

or

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉抗生物素，37℃或室溫孵育10-30 min。(SP法)

or

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗兔/抗鼠IgG多聚體，室溫30分鐘。(Envision法)

↓

PBS洗滌3分鐘，3次。

↓

顯色劑（DAB)顯色反應(yīng)，5-10分鐘。光鏡下控制顯色程度。蒸餾水洗終止顯色反應(yīng)。

↓

細(xì)胞核復(fù)染蘇木素3-5分鐘。流水沖洗藍(lán)化。

↓

脫水：70%→80%→90%→95%→100%→100%乙醇，每級(jí)5分鐘。

↓

透明：二甲苯2次，每次5分鐘。

↓

中性樹膠封固。

實(shí)驗(yàn)流程那么長(zhǎng)，看得有點(diǎn)累了？

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