因此重組抗體表達(dá)這項(xiàng)技術(shù)的研發(fā)也是基于抗體研究領(lǐng)域的科學(xué)家對于抗體多樣性研究和理解的基礎(chǔ)上，而普健生物也經(jīng)過多年的抗體表達(dá)實(shí)踐和對哺乳系統(tǒng)表達(dá)的優(yōu)化，研發(fā)出一項(xiàng)高效表達(dá)重組抗體的專有技術(shù)?？山?jīng)過本文來了解一下重組抗體表達(dá)技術(shù)以及抗體結(jié)構(gòu)和抗體多樣性產(chǎn)生的機(jī)制。
重組抗體表達(dá)
普健生物自有的哺乳表達(dá)系統(tǒng)高產(chǎn)量pATX系列載體及馴化293系列和CHO系列細(xì)胞，能實(shí)現(xiàn)全長抗體以及多種形式的重組抗體片段的高效分泌表達(dá)；無需免疫和篩選，直接利用抗體基因序列即可實(shí)現(xiàn)重組抗體的高產(chǎn)和可重復(fù)生產(chǎn)。
諸多表達(dá)優(yōu)勢
1. 抗體藥物研發(fā)專家和技術(shù)團(tuán)隊(duì)，提供個(gè)性化抗體發(fā)現(xiàn)整體方案，重組抗體表達(dá)量高，采用高密度轉(zhuǎn)染，可實(shí)現(xiàn)瞬轉(zhuǎn)表達(dá)量幾百毫克每升，穩(wěn)轉(zhuǎn)可優(yōu)化到克級。
2. 抗體表達(dá)經(jīng)驗(yàn)豐富，已成功表達(dá)過多種形式的全長抗體（Human IgG, mouse IgG, human Ig A, IgM, IgE, mouse IgM，rabbit IgG 等）和抗體片段（scFv，F(xiàn)ab，tandem-scfv，VHH，F(xiàn)c融合蛋白，bi-specific antibody等）。
3. 一站式服務(wù)：擁有多種服務(wù)平臺，在實(shí)現(xiàn)重組抗體設(shè)計(jì)表達(dá)和純化的同時(shí)，進(jìn)行抗體質(zhì)控和活性驗(yàn)證，并由經(jīng)驗(yàn)豐富的專家根據(jù)客戶需求進(jìn)行人源化設(shè)計(jì)驗(yàn)證。
4. 自主知識產(chǎn)權(quán)的GS敲除系統(tǒng)細(xì)胞系，長期穩(wěn)定表達(dá)，抗體質(zhì)量更穩(wěn)定。
5. 周期短，可提供2~3周急速交付重組抗體表達(dá)服務(wù)。
抗體的結(jié)構(gòu)及多樣化過程
典型的抗體分子由重鏈和輕鏈組成，形成的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域又可以分為可變區(qū)和恒定區(qū)，分別負(fù)責(zé)抗原的結(jié)合和下游免疫反應(yīng)的激活。
在B細(xì)胞發(fā)育早期階段，編碼可變區(qū)的V元件、J元件，以及重鏈可變區(qū)特有的D元件，可以通過核酸內(nèi)切酶RAG起始的V(D)J重排進(jìn)行組合和連接從而形成可變區(qū)基因外顯子，所分泌的低親和力IgM抗體構(gòu)成了初始的抗體庫。在外周淋巴組織結(jié)構(gòu)生發(fā)中心中，B細(xì)胞特異性DNA去氨酶AID能夠起始可變區(qū)高頻突變和重鏈恒定區(qū)抗體類型轉(zhuǎn)換，從而形成了表達(dá)高親和力不同抗體類型的抗體庫。
典型的抗體分子和抗體多樣化過程
體類型轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制
抗體類型轉(zhuǎn)換是抗體多樣化過程中的重要一步，其產(chǎn)生的不同類型抗體能夠激活不同的下游免疫反應(yīng)。
B細(xì)胞特異性DNA去氨酶AID起始了這一過程，產(chǎn)生的DNA斷裂則由細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)進(jìn)一步連接完成整個(gè)過程。遺傳學(xué)證據(jù)清晰地表明，抗體類型轉(zhuǎn)換由兩步組成：第一步，AID介導(dǎo)的雙鏈DNA斷裂的產(chǎn)生；第二步，雙鏈DNA斷裂激活DNA損傷應(yīng)答機(jī)制將兩個(gè)雙鏈DNA斷裂連接起來。
1. AID靶向基因組DNA底物引起雙鏈DNA斷裂的機(jī)制
A：AID去氨基酶活性示意圖。AID作用于N4位點(diǎn)，能夠?qū)捂淒NA上的胞苷(C)殘基脫氨產(chǎn)生尿苷(U)；B、C、D：基因組轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄泡、負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)以及R-環(huán)可以提供單鏈DNA招募AID；深色線條和淺色線條分別代表DNA雙鏈的模板鏈和非模板鏈，紅線代表RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。E：AID相互作用因子RPA復(fù)合物和RNA外切體復(fù)合物能夠?yàn)锳ID提供單鏈DNA底物。F：對向轉(zhuǎn)錄招募AID到非免疫球蛋白基因靶點(diǎn)：藍(lán)線代表轉(zhuǎn)錄, 紅線代表反轉(zhuǎn)錄。
2. 雙鏈DNA損傷修復(fù)與S區(qū)斷裂末端連接
抗體類型轉(zhuǎn)換中產(chǎn)生的S區(qū)的雙鏈DNA斷裂的修復(fù)，并不依賴于AID去氨酶活性。AID起始形成S區(qū)的雙鏈DNA斷裂可以激活細(xì)胞內(nèi)通用的雙鏈DNA損傷應(yīng)答系統(tǒng)，最終非同源DNA末端連接系統(tǒng)將兩個(gè)S區(qū)斷裂連接起來。
DNA末端修復(fù)連接途徑
A: ATM依賴的雙鏈DNA損傷應(yīng)答機(jī)制。MRN復(fù)合體可以識別DSB末端招募ATM并激活A(yù)TM激酶活性, 使多種下游蛋白包括H2AX、53BP1等發(fā)生磷酸化。磷酸化的H2AX即γ-H2AX可以進(jìn)一步招募其他雙鏈DNA損傷應(yīng)答因子MDC1, RNF8能夠與磷酸化的MDC1相互作用, 并泛素化修飾組蛋白H1。RNF168可以識別組蛋白H1泛素化修飾, 并進(jìn)一步泛素化修飾組蛋白H2A。53BP1識別組蛋白H2A泛素化修飾而進(jìn)一步招募至DNA損傷位點(diǎn)。ATM磷酸化的53BP1能夠招募Rif1進(jìn)一步抑制由CtIP介導(dǎo)的雙鏈DNA末端的單鏈切除, 從而使DNA斷裂末端更容易被非同源DNA末端連接途徑修復(fù)并同時(shí)抑制同源重組的發(fā)生。B:在c-NHEJ過程中,Ku結(jié)合至DSB末端, DNA-PKcs被進(jìn)一步招募至DNA的DSB上,XRCC4/Lig4復(fù)合物最終連接兩個(gè)末端。A-EJ途徑中, PARP1可能參與了對DSB的識別, Mrel 1和CtIP可能介導(dǎo)末端連接, 最終由Lig1或Lig3進(jìn)行末端連接。
重組抗體表達(dá)的相關(guān)研究進(jìn)展
抗體產(chǎn)生和多樣化過程的缺陷在臨床上表現(xiàn)為各種免疫缺陷疾病，而抗體多樣化的失控則可能造成B細(xì)胞淋巴瘤的產(chǎn)生。
抗體多樣化中，抗體基因在基因組水平面臨DNA修飾和損傷的發(fā)生。這種DNA水平的損傷雖然受到精細(xì)地調(diào)控，但往往也造成了基因組的不穩(wěn)定性導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。生發(fā)中心B細(xì)胞來源的B細(xì)胞淋巴瘤中，AID起始的DNA損傷產(chǎn)生的染色體易位、基因突變等是癌變的主要機(jī)制之一。研究AID靶向機(jī)制和抗體多樣化中DNA損傷修復(fù)機(jī)制，可以為生發(fā)中心來源的B細(xì)胞淋巴瘤，如濾泡型淋巴瘤、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤等，以及CLL的治療和診斷提供新的思路和技術(shù)手段。
目前我們對抗體多樣化機(jī)制的認(rèn)識仍存在大量的空白，致力于抗體類型的研究從未停歇。通過基因工程對編碼抗體的基因按不同需要進(jìn)行加工改造和重新裝配，轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞從而表達(dá)抗體，這種通過基因工程重組表達(dá)抗體的技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于抗體藥物研究。
重組抗體的優(yōu)勢
重組抗體包括嵌合抗體、人源化抗體、小分子抗體、雙特異性抗體等。與傳統(tǒng)的單克隆抗體和多克隆抗體相比，重組抗體具有獨(dú)特的優(yōu)勢，現(xiàn)已被廣泛地應(yīng)用在科學(xué)研究、免疫診斷及治療性抗體領(lǐng)域。在被廣泛應(yīng)用的情況下，重組抗體表達(dá)技術(shù)水平也在日益提高，重組抗體除了以上優(yōu)勢之外還有以下一些優(yōu)點(diǎn)。
（1）重組抗體具有序列已知、抗體基因可以長期保存、抗體性能穩(wěn)定、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，而單克隆細(xì)胞株可能存在抗體染色體丟失、細(xì)胞復(fù)蘇后停止生長或死亡等風(fēng)險(xiǎn)。
（2）可以進(jìn)行基因工程改造：重組抗體可以進(jìn)行重組改造，包括抗體片段表達(dá)，同型置換，嵌合抗體，抗體人源化等。
（3）可以大量制備抗體：重組抗體可以快速實(shí)現(xiàn)抗體的大量制備，不需要使用動(dòng)物，克服使用動(dòng)物的倫理問題。
