就像他們說的，
數(shù)學(xué)是火，點亮物理的燈；
物理是燈，照亮化學(xué)的路；
化學(xué)是路，通向生物的坑；
生物是坑，埋葬了理科生。
從678走來的我們，
都希望自己的人生從此"666",
然而現(xiàn)實卻有一萬種理由讓你“555“。
雖然經(jīng)常被人調(diào)侃
“生物專業(yè)不是文科嗎？”
當(dāng)年填報志愿時，
表哥那一句
"21世紀是生命科學(xué)的世紀"
仍回蕩在耳旁，
”激勵“著我前行。
作為專注蛋白表達的AtaGenix小編，
肯定要先扒一扒
那些SDS-PAGE的陳年往事。
畢竟，
敬業(yè)才是當(dāng)前最重要的。
↓
先從PAGE說起。
PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis），聚丙烯酰胺凝膠電泳，是以聚丙烯酰胺凝膠為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化。 催化聚合的常用方法有化學(xué)聚合法和光聚合法，化學(xué)聚合以過硫酸銨（APS）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。PAGE有Native-PAGE（非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳）和 SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝膠）兩種形式。Native-PAGE過程中蛋白質(zhì)能保持完整狀態(tài)，并依據(jù)分子量大小、形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。
而SDS-PAGE
僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同
就可以分開蛋白質(zhì)。
原因
↓
SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二三級結(jié)構(gòu)。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白-SDS 膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。
當(dāng)年的高考狀元（如今的實驗狗）對原理有更詳細的闡述：
SDS-PAGE一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，與連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比有較高的分辨率。先把較稀的樣品加在濃縮膠（作用是堆積，凝膠濃度較小，孔徑較大）上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選TRIS/HCl緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸時，電泳開始后，HCl解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快， 甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成一穩(wěn)定的界面，蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。當(dāng)樣品進入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進行分離。
SDS-PAGE的有效分離范圍取決于用于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度。在沒有交聯(lián)劑的情況下聚合的丙烯酰胺形成毫無價值的粘稠溶液，而經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián)后凝膠的剛性和抗張強度都有所增加，并形成SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物必須通過的小孔。這些小孔的孔徑隨 “甲叉雙丙烯酰胺-丙烯酰胺” 比率的增加而變小，比率接近 1：20 時孔徑達到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙丙烯酰胺-丙烯酰胺”為1：29 配制，試驗表明它能分離大小相差只有3% 的蛋白質(zhì)。用5-15%的丙烯酰胺所灌制凝膠的線性分離范圍如下表（雙丙烯酰胺-丙烯酰胺摩爾比為1：29）：
SDS-PAGE經(jīng)常應(yīng)用于蛋白提純過程中純度的檢測。純化的蛋白質(zhì)通常在SDS電泳上應(yīng)只有一條帶，但如果蛋白質(zhì)是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應(yīng)于各個亞基的幾條帶。SDS-PAGE具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級的蛋白質(zhì)，而且通過電泳還可以同時得到關(guān)于分子量的情況，這些信息對于了解未知蛋白及設(shè)計提純過程都是非常重要的。
但在做SDS-PAGE實驗過程中
有可能問題層出不窮
↓
SDS-PAGE二十二問給你答案
聚丙烯酰胺
丙烯酰胺為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)。
制膠緩沖液
濃縮膠選擇pH6.8，分離膠選擇pH8.8，選擇Tris-HCl系統(tǒng)。
TEMED與AP
AP 催化單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合成聚丙烯酰胺。TEMED是催凝劑，可加速AP催化作用。
SDS
陰離子去污劑，它能按一定比例與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成帶負電荷的復(fù)合物， SDS帶有大量負電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所帶的負電荷大大超過了蛋白質(zhì)原有的負電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負電荷，可利用分子量的差異將各種蛋白質(zhì)分開。
甘氨酸
它推動樣品中的蛋白質(zhì)前移并在分離膠前沿積聚。此處pH值較高， 有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過堆集的蛋白質(zhì)并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動穿過分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。
上樣緩沖液
蛋白上樣緩沖液(loading buffer)是一種以溴酚藍為染料，5倍濃縮的SDS-PAGE凝膠電泳上樣緩沖液,用于常規(guī)的SDS-PAGE蛋白電泳樣品上樣。一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。上樣緩沖液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，這可以阻止樣品從梳樣孔中擴散到電泳緩沖液。
根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：
還原SDS處理
在上樣buffer中加入SDS和DTT（或β-巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中只根據(jù)分子量來分離。
注：一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5 min，再離心加樣。
2帶有烷基化作用的還原SDS處理
碘乙酸胺的烷基化作用可以很好并經(jīng)久牢固地保護SH基團，得到較窄的譜帶。另外碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。
3非還原SDS處理
生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1% SDS沸水中煮3 min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。
3、兩塊玻璃板之間灌膠,膠為什么總是不平?
玻璃沒有洗干凈。
過硫酸銨和TEMED的用量不合適，用量相對較多，凝膠凝固過快膠就會不平。
加完試劑以后沒有很好地搖勻，導(dǎo)致有些部位的聚合劑濃度過高，聚合相對較快造成膠不平。
灌膠后沒有立刻用水或者異丙醇壓膠面：邊緣膠是不容易聚合完全的，灌完膠后要立即加異丙醇覆蓋。濃度越低的膠越不要使用雙蒸水壓頂。另外還可以在壓頂試劑如異丙醇中添加少許AP來增加邊緣膠的凝聚強度。
溫度也是影響膠聚合的重要因素，如果為了讓膠更快地凝固而把膠放到50度的溫箱，由于受熱不均勻，也會造成膠聚合不均勻。
每次電泳完后，洗凈玻璃、膠條和其他附件。
避免玻璃邊緣破損很重要，尤其是下面和膠條接觸的地方。
找一塊很平的桌面，使兩塊玻璃底面非常齊。
膠條一定要干，跑完電泳后，膠條可放在實驗臺上晾著。
下面的膠條注意不要老化，如果有裂紋的話可用保鮮膜墊在上面，或者反過來用。
玻璃在使用過程中容易造成小的缺口，從而導(dǎo)致封條無法完全密封。裝好架子后，可在玻璃底邊抹上一層薄薄的凡士林（兩邊多點，容易從兩邊漏）。轉(zhuǎn)移到電泳槽的時候去掉封條，把底上的凡士林擦干（注意一定要擦干凈，尤其是少量進入了兩塊玻璃之間空腔的，因為凡士林不導(dǎo)電，會影響電泳的效果）。
可以在海綿墊下再墊一些紙，使它與玻璃貼的更緊密，或者在玻璃底部用瓊脂糖封上。
先把兩塊玻片放在夾子上，使底部對齊，再夾緊兩塊玻片，然后取下再在其下面墊上墊片。
5、分離膠加上后為什么要立即加水？
一是為了使分離膠界面保持水平（用水就可以把它壓平），使蛋白質(zhì)分子跑時在同一水平線上。
二是阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。
6、怎么處理“ 微笑”（兩邊翹起中間凹下）條帶的形成？
主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致（多出現(xiàn)于較厚的凝膠中），可待其充分凝固再做后續(xù)實驗。
7、怎么處理“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？
常是由于垂直電泳時電泳槽的裝置不合適引起的,當(dāng)凝膠和玻璃板組成的"三明治"底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全便會產(chǎn)生這種現(xiàn)象?？稍趦砂彘g加入適量緩沖液，以排除氣泡。
8、出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象應(yīng)該怎么辦？
主要是樣品溶解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。可在加樣前離心、選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑、重新配制時間過長的電泳緩沖液或者降低凝膠濃度。
9、出現(xiàn)紋理（縱向條帶）現(xiàn)象應(yīng)該怎么辦？
主要是不溶性樣品顆粒引起的，可在加樣前離心或加適量樣品促溶劑。
10、蛋白帶偏斜怎么辦？
常常是由于濾紙條或電極放置不平行或加樣位置偏斜而引起，檢查位置是否正確并作出相應(yīng)調(diào)整。
11、蛋白帶過寬，與鄰近蛋白泳道的蛋白帶相連？
這是由于加樣量太多或加樣孔泄漏引起的，可減少加樣量。
12、蛋白帶模糊不清和分辨不佳？
聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。
建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
為了提高分辨率,不要加過多的樣品,小體積樣品可跑出窄帶。
加樣后應(yīng)立即電泳,以防止擴散。
選擇合適的凝膠濃度,使組分得以充分的分離。
樣品的蛋白水解作用（系統(tǒng)中的內(nèi)源性蛋白酶會水解樣品蛋白）也引起擴散而使分辨率降低，在緩沖液中加蛋白酶抑制劑可減少這種情況的發(fā)生。
13、什么是“鬼帶”，如何處理？
在跑構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時，“鬼帶”常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀。主要是還原劑在加熱過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻與目標條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標條帶對應(yīng)的抗體作用。可在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta-巰基乙醇，以補充不足的還原劑或加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。
14、為什么溴酚藍不能起到指示作用？
我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象,這主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)，可更換正確pH值的緩沖液或降低分離膠的濃度。
15、為什么電泳的條帶很粗？
電泳中條帶很粗是常見的事，主要是蛋白未濃縮好的原因?？蛇m當(dāng)增加濃縮膠的長度，保證濃縮膠貯液的pH正確（pH6.7）或適當(dāng)降低電壓。
16、為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？
這種現(xiàn)象一般初學(xué)者容易遇到。比如電壓50 v以上，可電流卻在5 mA以下。這主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路所致。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。將電泳槽正確裝配即可。
17、濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？
一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致，后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊導(dǎo)致空氣進入引起的。
18、蛋白帶型聚團是什么引起的？
上樣過量：降低蛋白上樣量或降低蛋白濃度。
樣品粘度過大：延長煮沸時間。
樣品中含有不溶物質(zhì)：離心或過濾樣品以除去特定污染物。
制膠不佳：確保制膠均勻，一次完成。
19、凝膠時間不對，或慢或快，怎么回事？
通常膠在30 min-1 h內(nèi)凝固。如果凝的太慢，可能是TEMED和APS劑量不夠或者失效。APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用。TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色，以此可以鑒定TEMED的質(zhì)量。如果無法獲得無色透明的TEMED，只能適當(dāng)增加用量以保證聚膠速度。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過多，此時膠太硬易裂，電泳時易燒膠。
20、電泳時間比正常要長？
可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電極緩沖系統(tǒng)的PH選擇錯誤，即緩沖系統(tǒng)的PH和被分離物質(zhì)的等電點差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強度太高。
21、蛋白Marker條帶缺失或條帶模糊怎么辦？
分離膠濃度不正確：配置濃度正確的分離膠。
緩沖液放置時間過長：定期更換緩沖液。
甲叉丙烯酰胺貯存液放置時間過長或配置不準確：及時更新貯存液，此貯存液配制時在37℃水浴溶解30 min以上。
電泳時間過長：觀察前面的指示劑染料，掌握恰當(dāng)?shù)碾娪緯r間。
22、條帶跑得比正常的窄？
可能因為膠凝得不均勻，聚合得不是很好：灌膠的時候盡量混勻。
可能與拔梳子有關(guān)：拔梳應(yīng)該迅速。
沖洗加樣孔時要小心，以免把上樣帶扭曲。
膠配好了用槍吹幾下再灌膠。
等指示劑跑到兩層膠交界成一線時，再調(diào)高電壓。
可能是樣品的問題：如果鹽濃度較高，便會擠壓其它條帶，致使條帶寬窄不一。
常見的原因是每孔上樣量不均勻：應(yīng)確保每孔中上樣量一致。
有可能是電極緩沖液，也有可能是凝膠緩沖液：更新緩沖液。
