假如世界上真的有唐僧肉，
我絕對想當(dāng)妖精。
然而人類長生不老的問題一直懸而未決，
所以，
我們才會(huì)總是問活著的意義。
為了避諱，
生物學(xué)上的“死亡”，
不同的社會(huì)學(xué)說法就有兩百多種。
還有一種叫做“凋亡”，
是生物體組成基本單位——細(xì)胞
的消失方式之一，
它完美地詮釋了
一種從容不迫的態(tài)度。
那么，
什么是凋亡呢？
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細(xì)胞凋亡（Apoptosis）,又稱程序性細(xì)胞死亡（Programmed Cell Death，PCD），是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命，有一系列酶參與、由基因控制的一個(gè)主動(dòng)的、高度有序的、非炎癥性細(xì)胞死亡的過程。近年來已在很多領(lǐng)域如胚胎學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、免疫學(xué)，尤其是腫瘤學(xué)方面引起廣泛的興趣和關(guān)注，其研究可能有助于闡明腫瘤發(fā)病機(jī)理并為其治療提供嶄新的途徑。
細(xì)胞凋亡不同于細(xì)胞壞死：
細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別
壞死（necrosis）是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程，表現(xiàn)為細(xì)胞脹大、胞膜破裂、細(xì)胞內(nèi)容物外溢、核變化較慢、DNA降解不充分和引起嚴(yán)重的局部炎癥反應(yīng)等。
凋亡是細(xì)胞對環(huán)境的生理性或病理性刺激信號(hào)、環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過程，是一種基本的細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物中起著去除不需要細(xì)胞或異常細(xì)胞的作用。表現(xiàn)為細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落等現(xiàn)象。
原來如此~
那么小編不禁想問，
怎么才能知道一個(gè)細(xì)胞是否凋亡呢？
別擔(dān)心，
人類有很多種檢測細(xì)胞凋亡的方法，
下面主要介紹兩種：
最直觀的當(dāng)然是“看”啦：
1
形態(tài)學(xué)觀察
光鏡下細(xì)胞凋亡最早變化有細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞核固縮、染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)、核碎裂、細(xì)胞漿和細(xì)胞器密度增高，細(xì)胞膜皺折、卷曲、出泡、胞漿膜包裹細(xì)胞碎片“凋亡小體”，凋亡小體是細(xì)胞凋亡的特征性改變。
電鏡下可見在細(xì)胞凋亡的早期細(xì)胞核染色體發(fā)生邊集，在細(xì)胞核膜周邊聚集成新月體形，隨之染色體發(fā)生固縮、電子密度增強(qiáng)、核形不規(guī)整，核碎裂成碎片、細(xì)胞體積變小、胞漿濃縮、空泡增多，可見細(xì)胞膜丫生出泡現(xiàn)象；在凋亡晚期可見膜泡內(nèi)有較完整的細(xì)胞器和細(xì)胞核碎片的凋亡小體。
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凋亡小體的形成示意
除了宏觀上的定性觀察，
還有更精確的定量檢測。
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2
生化特征檢測
細(xì)胞凋亡最明顯的生化特征是Ca2 + 、Mg2+ 依賴性內(nèi)源性核酸酶的激活將細(xì)胞核染色體從核小體間斷裂，形成由大約為180 - 200bp 或其多聚體組成的寡核苷酸片段。
DNA凝膠電泳法
DNA 凝膠電泳表現(xiàn)在：正?；罴?xì)胞 DNA電泳為一條區(qū)帶,細(xì)胞凋亡時(shí)核酸內(nèi)切酶將DNA 分解成規(guī)則的180-200bp的DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳中就呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜，而壞死呈彌漫的連續(xù)圖譜。DNA 電泳法的缺點(diǎn)是不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量，只能進(jìn)行半定量。其靈敏性較差，要求所測標(biāo)本細(xì)胞數(shù)在106 以上才能使電泳清晰。實(shí)驗(yàn)流程如下：收集細(xì)胞（5×106-107個(gè)cell ）→ DNA 提?。ǚ勇确?、氯仿抽提）→瓊脂糖凝膠電泳→結(jié)果分析。
TUNEL法
TUNEL法（terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記測定法)也稱DNA 斷裂的原位末端標(biāo)記法，這一方法能對DNA分子斷裂缺口中的3'-OH進(jìn)行原位標(biāo)記，借助一種可觀測的標(biāo)記物(如熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物)，能對凋亡細(xì)胞的核DNA中產(chǎn)生的3'-OH末端進(jìn)行原位標(biāo)記，用熒光顯微鏡即可進(jìn)行觀察。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有 DNA 的斷裂，因而沒有 3'-OH 形成，很少能夠被染色。TUNEL 實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測定。
Annexin V法
磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35~36kD 的Ca2 +依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將 Annexin-V 進(jìn) 行 熒 光 素（FITC、PE）標(biāo) 記，以標(biāo)記了的Annexin-V 作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidine iodide ，PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。實(shí)驗(yàn)流程如下：收集細(xì)胞（5×105~106 ）→ 細(xì)胞染色（Annexin V，F(xiàn)ITC 凋亡檢測試劑盒）→流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測→專業(yè)流式軟件結(jié)果分析（如flowjo ）。
Caspase-3活性檢測法
Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32 kD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17 kD）和兩個(gè)小亞基（12 kD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞中，caspase-3的活性明顯下降。實(shí)驗(yàn)流程：（以Western blot 分析為例）收集細(xì)胞→PBS洗滌→蛋白提取→蛋白定量→SDS-PAG電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉(zhuǎn)移→5%脫脂奶粉封閉→一抗孵育（Caspase-3多抗或單抗）→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗滌→二抗孵育→ TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗滌→ECL顯影或NBT/BCIP顯色→結(jié)果分析及判定。
幫人幫到底，送佛送到西。
除了告訴你怎么做，我們還會(huì)指點(diǎn)你怎么辦~
且看
常見問題
解決方案
1
如何選擇合適的凋亡檢測方法?
定性的研究方法可選DNA電泳法、形態(tài)學(xué)觀察（普通光學(xué)顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡）；定量或半定量的研究方法可選各種流式細(xì)胞儀方法、原位末端標(biāo)記法等。DNA瓊脂糖凝膠電泳法敏感性不高，大量凋亡細(xì)胞同時(shí)存在時(shí)才出現(xiàn)典型的結(jié)果，且只能用于細(xì)胞群體，不能用于組織的原位檢測；TUNEL法可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用；細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜上的PS外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此Annexin V聯(lián)合PI染色法檢測早期細(xì)胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。并且Annexin V聯(lián)合PI染色不需固定細(xì)胞，可避免PI染色因固定造成的細(xì)胞碎片過多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯(lián)合PI法更加省時(shí)，結(jié)果更為可靠，是目前最為理想的檢測細(xì)胞凋亡的方法。
2
Annexin V法通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡時(shí)
沒有凋亡信號(hào)/沒有早期凋亡信號(hào)？
沒有檢測到凋亡信號(hào)說明細(xì)胞未被染料標(biāo)記上。不同公司生產(chǎn)的Annexin V、FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的生產(chǎn)工藝流程都不一樣。首先檢查試劑盒儲(chǔ)存是否正確（4度還是-20度）以及保質(zhì)期；其次檢查是否嚴(yán)格按照試劑盒所提供的實(shí)驗(yàn)說明進(jìn)行操作。
3
Annexin V法通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡時(shí)
凋亡信號(hào)值過高？
在實(shí)驗(yàn)操作過程中應(yīng)動(dòng)作輕柔、迅速，避免影響細(xì)胞的活力及形態(tài)。在處理貼壁細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，消化時(shí)間不宜太長，染色操作完成時(shí)應(yīng)盡快上機(jī)檢測。
