上篇流式小課堂的第一期，我們帶大家簡(jiǎn)單了解流式檢測(cè)平臺(tái)【第一期】流式小課堂。從本篇開(kāi)始我們將以 step by step 的方式各個(gè)擊破關(guān)于流式實(shí)驗(yàn)的相關(guān)難點(diǎn)。

我們知道流式細(xì)胞術(shù)是基于特定激光激發(fā)下，細(xì)胞產(chǎn)生的熒光被流式儀接收器接收。那么流式儀所接收的光信號(hào)一定就是應(yīng)該素被激發(fā)之后所產(chǎn)生的嗎？答案是否。這里我們要引入一個(gè)概念---非特異性熒光。所謂非特異性熒光是指：細(xì)胞表面的某些分子或者結(jié)構(gòu)能夠產(chǎn)生熒光，這種熒光相對(duì)于熒光素產(chǎn)生的熒光較弱，并且與細(xì)胞表面的特異抗原分子沒(méi)有相關(guān)性。由于非特異性熒光的存在，在特定激光激發(fā)下，細(xì)胞產(chǎn)生的熒光并不是絕對(duì)的有或者無(wú)，細(xì)胞表面不結(jié)合流式熒光素也會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)。這就給我們分析流式結(jié)果時(shí)帶來(lái)了一定的難度，相當(dāng)于我們通過(guò)流式檢測(cè)時(shí)得到的熒光信號(hào)是細(xì)胞本身的非特異性熒光和來(lái)自于細(xì)胞表面結(jié)合的熒光素的特異性熒光疊加得到的結(jié)果。

陰性對(duì)照

由于存在光信號(hào)疊加，因此在分析流式結(jié)果時(shí)我們需要比較熒光信號(hào)與細(xì)胞的非特異性熒光。如果得到的熒光信號(hào)大于非特異性熒光，說(shuō)明得到的熒光信號(hào)部分來(lái)源于熒光素的特異性熒光，就可以得出細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)的抗原分子的結(jié)論。所以，確定與熒光素?zé)o關(guān)的細(xì)胞自身的非特異性熒光的強(qiáng)弱非常重要，設(shè)立陰性對(duì)照就是為了確定細(xì)胞的非特異性熒光。

上圖為3類陰性對(duì)照和標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體(抗CD69-PE)得到的熒光信號(hào)的示意圖。相比于前面3類陰性對(duì)照，可以得出這群樣品細(xì)胞中有30％的細(xì)胞表達(dá)有CD69抗原分子。如果沒(méi)有陰性對(duì)照作為參照，直接根據(jù)最后標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體組的熒光信號(hào)無(wú)法判斷樣品細(xì)胞中有多少比例的細(xì)胞表面結(jié)合有PE熒光素，從而也就無(wú)法判斷有多少比例的細(xì)胞表達(dá)CD69抗原分子。

第1類

negative

“negative”表示的是不加任何熒光素偶聯(lián)抗體時(shí)得到的熒光信號(hào)，因?yàn)闆](méi)有標(biāo)記任何熒光素，所以這組得到的熒光信號(hào)與熒光素?zé)o關(guān)，與細(xì)胞抗原分子是否表達(dá)無(wú)關(guān)，得到的熒光信號(hào)代表的是非特異性熒光信號(hào)；

第2類

抗CD69

“抗CD69”表示的是用抗CD69抗體標(biāo)記樣品細(xì)胞后得到的熒光信號(hào)，雖然抗CD69抗體能夠與細(xì)胞表面的CD69抗原分子結(jié)合，但是抗CD69抗體沒(méi)有偶聯(lián)熒光素，所以得到的熒光信號(hào)也與細(xì)胞表面是否表達(dá)有CD69分子無(wú)關(guān)，得到的熒光信號(hào)代表的也只是細(xì)胞本身的非特異性熒光，所以這種對(duì)照用于排除抗體的影響；

第3類

IgG1-PE

“IgG1-PE”表示的是標(biāo)記與抗CD69抗體同種屬（來(lái)源于同一物種）且同類（抗CD69-PE中的抗體是IgG1類的）的非特異性抗體（IgG1）與PE熒光素偶聯(lián)的同型（isotype）對(duì)照抗體（IgG1-PE）后，得到的熒光信號(hào)，這種同型對(duì)照抗體不能與細(xì)胞表面的CD69發(fā)生特異性結(jié)合，所以細(xì)胞表面不會(huì)結(jié)合有IgG1-PE，最后得到的熒光信號(hào)不是PE熒光素產(chǎn)生的特異性熒光信號(hào)，而是代表細(xì)胞本身的非特異性熒光，所以這種對(duì)照用于排除熒光素的影響。第3類同型對(duì)照抗體就是我們?cè)诹魇綄?shí)驗(yàn)中最常設(shè)置的同型對(duì)照。

FMO對(duì)照

減一陰性對(duì)照（Fluorescence-minus-onecontrol，F(xiàn)MO對(duì)照）是一種特殊的陰性對(duì)照，是指在多色（通道）分析時(shí)對(duì)其中某一個(gè)通道特別設(shè)置的陰性對(duì)照，多在研究不同細(xì)胞亞群表達(dá)某些重要的表型分子、細(xì)胞因子等時(shí)應(yīng)用。

如需要研究人外周血單個(gè)核細(xì)（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中CD62L+CD4+和CD62L-CD4+兩個(gè)細(xì)胞亞群表達(dá)CD45RA這個(gè)重要表型分子的表達(dá)情況時(shí)，需要同時(shí)標(biāo)記不同熒光素偶聯(lián)的抗人CD4、CD62L和CD45RA抗體，除了常規(guī)的陰性對(duì)照設(shè)置，最好再設(shè)置一組FMO對(duì)照，就是只標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗人CD4和CD62L抗體，而不標(biāo)記熒光素偶聯(lián)的抗人CD45RA抗體，然后將CD62L+CD4+和CD62L-CD4+細(xì)胞亞群分別設(shè)門(mén)，將兩群細(xì)胞分別顯示于新的散點(diǎn)圖中，散點(diǎn)圖上其中一個(gè)軸代表CD45RA的熒光信號(hào)，這時(shí)就可以分別設(shè)置這兩個(gè)細(xì)胞亞群CD45RA通道的陰陽(yáng)性界線，然后再上樣分析實(shí)驗(yàn)組，根據(jù)不同細(xì)胞亞群各自的陰陽(yáng)性界線分別判定細(xì)胞亞群各自表達(dá)CD45RA的情況。這種特殊的陰性對(duì)照就是FMO對(duì)照。因?yàn)椴煌?xì)胞亞群的非特異性熒光可能存在差異，而且不同細(xì)胞亞群結(jié)合有不同的熒光素偶聯(lián)抗體從而使它們的最佳補(bǔ)償值存在差異，當(dāng)在統(tǒng)一的補(bǔ)償條件下同時(shí)分析時(shí)，不同細(xì)胞亞群在某一通道的陰陽(yáng)性界線就可能存在差異，普通陰性對(duì)照無(wú)法進(jìn)一步區(qū)分這種差異，而FMO對(duì)照就可以通過(guò)只缺少標(biāo)記這一通道代表的熒光素偶聯(lián)抗體，精確界定不同細(xì)胞亞群各自的這一通道的陰陽(yáng)性界線，從而使流式分析結(jié)果更加精確。

陽(yáng)性對(duì)照

說(shuō)完了陰性對(duì)照，我們來(lái)講講陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置。流式實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照，是指在使用某種熒光素偶聯(lián)抗體前先檢測(cè)該熒光素偶聯(lián)抗體是否有效。

陽(yáng)性對(duì)照并不是每次流式分析時(shí)都必須設(shè)置，以下是需要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照的情況，給大家參考判斷：

1.使用新的熒光素偶聯(lián)抗體時(shí)，該熒光素偶聯(lián)抗體以前沒(méi)有使用過(guò)。

2.換用不同公司的或者同一公司但不同批號(hào)的熒光素偶聯(lián)抗體時(shí)。

3.使用儲(chǔ)存時(shí)間較長(zhǎng)的熒光素偶聯(lián)抗體時(shí)。

當(dāng)出現(xiàn)以上三種情況時(shí)，熒光素偶聯(lián)抗體會(huì)因?yàn)槭Ф鴮?dǎo)致無(wú)法與抗原分子結(jié)合產(chǎn)生特異性的熒光信號(hào)，從而得到一個(gè)假陰性的結(jié)果。

設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照通常我們使用以下兩種方法：

01

肯定表達(dá)有相應(yīng)抗原分子的樣品細(xì)胞來(lái)檢測(cè)，如檢測(cè)熒光素（不管哪種熒光素）偶聯(lián)的抗小鼠CD4抗體，可以用該抗體標(biāo)記正常小鼠的脾臟細(xì)胞，因?yàn)樵摷?xì)胞內(nèi)肯定有CD4陽(yáng)性細(xì)胞，而且已知CD4陽(yáng)性細(xì)胞占脾臟細(xì)胞的大致比例范圍，所以如果用該抗體標(biāo)記脾臟細(xì)胞得到意料中的結(jié)果時(shí)，就可以認(rèn)為該抗體有效；

02

如果實(shí)驗(yàn)室有已證明有效地與待測(cè)熒光素偶聯(lián)抗體的單克隆抗體相同但偶聯(lián)的熒光素不同的熒光素偶聯(lián)抗體，如需檢測(cè)FITC偶聯(lián)的抗小鼠CD4抗體（FITC-CD4抗體）是否有效，實(shí)驗(yàn)室已有證明有效的PE偶聯(lián)的抗小鼠CD4抗體（PE-CD4抗體），這時(shí)可以用這兩種熒光素偶聯(lián)抗體同時(shí)標(biāo)記同一份肯定表達(dá)有相抗原分子（CD4分子）的樣品細(xì)胞，流式檢測(cè)后如果PE陽(yáng)性的細(xì)胞FITC也是陽(yáng)性的，PE陰性的細(xì)胞FITC也是陰性的，就可以證明該待測(cè)的熒光素偶聯(lián)抗體有效。

以上就是關(guān)于流式實(shí)驗(yàn)中對(duì)照設(shè)置的相關(guān)知識(shí)，下一篇我們將繼續(xù)介紹流式實(shí)驗(yàn)如何選擇流式細(xì)胞術(shù)常用的熒光素。敬請(qǐng)期待~

關(guān)于普健

普健生物（AtaGenix）于2012年在武漢成立，作為武漢國(guó)家生物產(chǎn)業(yè)基地公共服務(wù)平臺(tái)—光谷抗體發(fā)現(xiàn)與篩選公共服務(wù)平臺(tái)。普健生物（AtaGenix）專注于重組蛋白、抗體、診斷原料、抗體藥物發(fā)現(xiàn)等自主技術(shù)平臺(tái)的建設(shè)和下游生物醫(yī)藥產(chǎn)品的戰(zhàn)略合作。經(jīng)過(guò)10年的發(fā)展，普健生物已成為一家立足武漢，業(yè)務(wù)覆蓋全國(guó)、輻射全球的高新技術(shù)服務(wù)企業(yè)。目前公司擁有4200平米自建實(shí)驗(yàn)室（包含800平高標(biāo)準(zhǔn)BSL-2級(jí)細(xì)胞房），擁有齊全蛋白抗體開(kāi)發(fā)設(shè)備500余套，包括高通量蛋白純化儀、Agilent 流式細(xì)胞分析儀，全自動(dòng)HPLC分析儀，openSPR蛋白、抗體親和力測(cè)定儀，Olympus熒光顯微鏡， BTX電融合儀，微生物發(fā)酵罐，中試型高壓均質(zhì)機(jī)，全自動(dòng)管式化學(xué)發(fā)光儀，以及配套的高速離心機(jī)，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀及大容量細(xì)胞培養(yǎng)搖床。公司先后獲得榮譽(yù)：3551人才計(jì)劃、高新技術(shù)企業(yè)、技術(shù)先進(jìn)型服務(wù)企業(yè)、光谷瞪羚企業(yè)