久久综合日本久久综合,亚洲成AV人片在线观看天堂无码,国产在线视频不卡一区二区,久久久久看免费高清特色大片

武漢佰樂博生物技術(shù)有限公司
   
     
聯(lián)系熱線
  • 聯(lián)系人:方經(jīng)理
  • 電 話:027-65279366
  • 郵箱:products@biolabreagent.com
  • 地 址:武漢市東湖新技術(shù)開發(fā)區(qū)神墩四路666號(hào)C棟

實(shí)力:TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

發(fā)表時(shí)間:2022-11-14

先來看一下什么是細(xì)胞凋亡~

細(xì)胞凋亡(Apoptosis)一般是指機(jī)體細(xì)胞在發(fā)育過程中或在某些因素作用下,通過細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡(Programmed Cell Death)。

它很重要

細(xì)胞凋亡對胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生、組織內(nèi)正常細(xì)胞群的穩(wěn)定、機(jī)體的防御和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時(shí)引起的細(xì)胞損傷、老化和腫瘤的發(fā)生進(jìn)展起著重要作用,并具有潛在的治療意義。

典型特征是

細(xì)胞凋亡途徑中各事件的發(fā)生是有時(shí)序性的,即各事件按先后順序依次發(fā)生,最終導(dǎo)致凋亡小體的出現(xiàn),細(xì)胞隨后發(fā)生凋亡。典型特征為:細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸(PS)的外翻;線粒體膜電位的喪失;細(xì)胞核凝縮和斷裂。在細(xì)胞凋亡的中晚期,核酸內(nèi)切酶(某些Caspase 的底物)的活化是關(guān)鍵的過程,在核小體之間剪切核DNA,導(dǎo)致核DNA 被裂解成180-200 bp大小的寡核苷酸片段。因此,這個(gè)過程被用于檢測凋亡,在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)典型的“DNA 梯形帶”。


但是……

這種方法既不能檢測單個(gè)細(xì)胞水平的凋亡,又不能提供細(xì)胞發(fā)生凋亡所處的組織位置和細(xì)胞分化狀態(tài)等方面的信息。

解決辦法

由脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法,即經(jīng)典的TUNEL法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling)可以解決以上問題:細(xì)胞凋亡晚期,染色體DNA雙鏈或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3-OH末端,可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下,將熒光素/酶標(biāo)記的dUTP結(jié)合到DNA的3-OH末端,從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測。



TUNEL法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法。對完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色,能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征,由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂,因而沒有3-OH形成,很少能夠被染色。TUNEL法可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的形態(tài)測定,并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞,因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。



更重要的是

AtaGenix 經(jīng)過不斷的嘗試與努力,自主研發(fā)的TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡試劑盒已經(jīng)面世!

相關(guān)信息參考官網(wǎng)

http://www.atagenix.com/

產(chǎn)品中心相關(guān)說明。



請認(rèn)準(zhǔn)如下包裝

產(chǎn)品質(zhì)量肯定沒問題,

自測效果杠杠的~

TNBC 組織冷凍切片(200 ×)


LTEP 組織石蠟切片(200 ×)


該試劑盒共有三種規(guī)格


組分

ABC001

 (20T)

ABC001

(50T)

ABC001

(100T)

10x  Equilibration 

Buffer

1.5 ml

1.5 mlx2

1.5 mlx4

Fluorescein-12-dUTP 

Nucleotide Mix

100 μl

250 μl

500 μl

Recombinant TdT 

Enzyme

20 μl

50 μl

100 μl

Proteinase K

20 μl

50 μl

100 μl

保存方式:-15 ~ -25℃保存, Fluorescein-12-dUTP Nucleotide MIX避光保存于-20oC。


試劑盒優(yōu)點(diǎn)

靈敏度高

背景染色極低,陽性染色強(qiáng),可以在單個(gè)細(xì)胞水平檢測到細(xì)胞凋亡。同時(shí)由于凋亡早期就有DNA斷裂,可以檢測到早期的細(xì)胞凋亡。

特異性好

TUNEL檢測時(shí)通常更容易標(biāo)記凋亡細(xì)胞,而不容易標(biāo)記壞死細(xì)胞,也不會(huì)檢測出射線等誘導(dǎo)的DNA斷裂(和細(xì)胞凋亡時(shí)的斷裂方式不同),既可以把凋亡和壞死區(qū)分開,也不會(huì)把射線等誘導(dǎo)發(fā)生DNA斷裂的非凋亡細(xì)胞判斷為凋亡細(xì)胞。

注意:極少數(shù)細(xì)胞凋亡時(shí)沒有DNA斷裂,此時(shí)不適用TUNEL法檢測。在個(gè)別類型的壞死細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)TUNEL檢測呈陽性。在需要嚴(yán)格判斷細(xì)胞凋亡的情況下,最好同時(shí)檢測多個(gè)凋亡指標(biāo)。

快速方便

只需將固定好的細(xì)胞或組織經(jīng)染色及洗滌后,即可置于熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞儀下進(jìn)行凋亡檢測,整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作僅需1-2小時(shí)即可完成。

應(yīng)用范圍廣

可以用于檢測冷凍切片或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況,也可以檢測培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況。

靈活

適于固定的細(xì)胞和組織,可以使樣品收集、儲(chǔ)存和運(yùn)輸成為可能。

質(zhì)優(yōu)

每一批產(chǎn)品在出售前都經(jīng)過嚴(yán)格的檢查。



產(chǎn)品使用說明

樣品預(yù)處理


細(xì)胞樣品

細(xì)胞爬片或者細(xì)胞涂片經(jīng)PBS洗滌后,4%多聚甲醛室溫固定30分鐘,PBS洗滌,再經(jīng)終濃度為0.02 μg/μl的Proteinase K溶液通透5-10分鐘;PBS洗滌3次,每次5分鐘。

注意:細(xì)胞涂片要做好防脫處理。

組織切片

石蠟切片 

(1)室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中脫蠟10-20分鐘。換用新鮮的二甲苯,再脫蠟10-20分鐘。

(2)室溫下用梯度乙醇(100%(Ⅰ)、100%(Ⅱ)、95%、80%、70%)各浸泡5分鐘。

(3)PBS浸泡潤洗切片,滴加終濃度為0.02 μg/μl的Proteinase K溶液通透15-20分鐘。

(4)PBS洗滌3次,每次5分鐘。

注意:這一步必須把Proteinase K洗滌干凈,否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。


冰凍切片 

(1)將玻片短暫回溫后浸沒在4%多聚甲醛溶液 (溶于PBS)中,室溫孵育30分鐘。

(2)PBS浸泡潤洗切片,滴加終濃度為0.02 ug/ul的Proteinase K溶液通透10-15分鐘。

(3)PBS洗滌3次,每次5分鐘。

注意:Proteinase K幫助組織和細(xì)胞進(jìn)行染色劑的通透,孵育時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致組織或細(xì)胞從切片上脫落,過短則造成通透性處理不充分,影響標(biāo)記效率,為了得到最好的結(jié)果,可能需要優(yōu)化通透時(shí)間。

陽性樣本和陰性樣本的處理

(1)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置陽性對照組和陰性對照組,按比例用去離子水稀釋DNase I Buffer,配置1x的DNase I Buffer溶液,陽性對照組滴加終濃度為10 U/ml的DNase I緩沖液,實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組滴加1x的DNase I Buffer使其完全覆蓋,濕盒孵育10 min。

(2)去掉多余的液體,并將載玻片用去離子水徹底洗3-4次。

染色標(biāo)記


參考下表配置一定量的TUNEL檢測液:

試劑組分

實(shí)驗(yàn)組

陽性對照組

陰性對照組

1x  Equilibration

 Buffer

44 μl

44 μl

44 μl

Fluorescein-12

-dUTP 

Nucleotide Mix

5 μl

5 μl

5 μl

Recombinant  

TdT Enzyme

1 μl

1 μl

-

ddH2O

-

-

1 μl

注意:TUNEL檢測液必須一次性使用完畢,避免凍存。

(1)用去離子水按1:10稀釋10x反應(yīng)平衡液配置成1x反應(yīng)平衡液。

(2)按照表格比例配置TUNEL檢測液,每組切片滴加適量的TUNEL檢測液使其完全覆蓋(針對涂片、切片或者96孔板、48孔板、24孔板及12孔板,一般50 μl TUNEL檢測液可足夠用于大小約為2.5*2.5cm的樣本),室溫濕盒避光孵育60分鐘。

(3)將切片置于PBS或HBSS溶液中室溫浸洗2次,每次5分鐘。

(4)吸干切片上多余的水分,避免干片,滴加0.05 μg/μl的DAPI溶液,室溫濕盒避光孵育10分鐘。

(5)將切片置于PBS溶液室溫浸洗3次,每次5分鐘。

(6)用抗熒光猝滅封片劑封片。

觀察檢測


熒光顯微鏡下觀察,激發(fā)波長范圍450-500 nm,發(fā)射波長范圍515-565 nm。


流式細(xì)胞術(shù)檢測懸浮細(xì)胞

(1)將3-5×106個(gè)細(xì)胞用PBS洗2次,每次4℃,1500 rpm,離心10分鐘。然后0.5 ml PBS重懸。

(2)固定細(xì)胞:加入1 ml 4%配制于PBS中的多聚甲醛溶液,冰上放置30分鐘。

(3)4℃,1500 rpm,離心5分鐘,去上清并且重懸于1 ml PBS。重復(fù)洗一次并用0.5 ml PBS重懸細(xì)胞。

(4)通透細(xì)胞:細(xì)胞可用配制于PBS中的0.1% Triton ® X-100溶液通透,室溫放置5分鐘,或者用0.1 μg/μl的Proteinase k溶液,室溫放置5分鐘。

(5)1500 rpm,離心5分鐘,棄上清,細(xì)胞重懸于1 ml PBS。

(6)轉(zhuǎn)移細(xì)胞至一個(gè)1.5 ml的微量離心管。

(7)1500 rpm離心5分鐘,去上清并把沉淀重懸在80 μl 1x Equilibration Buffer (按1:10的比例用去離子水稀釋10x Equilibration Buffer)中。室溫孵育30分鐘。

(8)細(xì)胞在1500 rpm離心10分鐘,去上清并把沉淀重懸在50 μl TdT孵育緩沖液中。37℃避光孵育60分鐘。

(9)直接加入DAPI染液,使其終濃度為0.05 μg/ml,避光室溫孵育10分鐘。

(10)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。測量495-520 nm的Fluorescein-12-dUTP的綠色熒光和364-454 nm的DAPI的藍(lán)色熒光。

注意:DAPI將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成藍(lán)色。只有凋亡的細(xì)胞核中有FITC-12-dUTP摻入而產(chǎn)生的綠色熒光。




以上就是該試劑盒的使用流程。


但事情還沒有這么簡單


 注意事項(xiàng)


試劑準(zhǔn)備階段

實(shí)驗(yàn)需自備陽性對照相關(guān)DNase I Buffer及DNase I;用于洗滌細(xì)胞的PBS或HBSS;用于封片的抗熒光淬滅封片液;用于固定的4%多聚甲醛免疫染色固定液及用于通透的含0.3% Triton X-100的免疫染色強(qiáng)力通透液。


樣品準(zhǔn)備階段 

?懸浮細(xì)胞:可以按照細(xì)胞懸液的TUNEL檢測方式操作,上流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果,需要起始細(xì)胞量不低于3–5×106個(gè)細(xì)胞。

?貼壁細(xì)胞:制作細(xì)胞爬片,用作爬片的玻片最好用多聚賴氨酸處理,防止脫片。

?細(xì)胞涂片:制備密度為5×10cells/ml的細(xì)胞懸液,取100 μl涂片。用來制作涂片的玻片最好用多聚賴氨酸處理。

建議:細(xì)胞樣品以細(xì)胞爬片或涂片的方式進(jìn)行檢測。


對照的設(shè)置 

  • 陽性對照

切片對照可使用DNaseⅠ部分降解的標(biāo)本。細(xì)胞對照可使用地塞米松(1 um)處理3-4 h 的大、小鼠胸腺細(xì)胞和人外周血淋巴細(xì)胞。

意義:可判斷實(shí)驗(yàn)方法和操作有無問題。

  • 陰性對照

不加TdT酶,其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

意義:排除凋亡外的非特異性染色。


溫馨提示 

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究使用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品。 為了您的安全,請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。


盡管如此,

也不排除實(shí)驗(yàn)過程中會(huì)出現(xiàn)一些問題,

比如:


熒光高背景?
  • 高速分裂或增殖的細(xì)胞,有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核DNA斷裂。

  • TUNEL反應(yīng)過強(qiáng):可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液稀釋TdT酶2-5倍后再操作。稀釋后的TdT酶需當(dāng)日使用完畢。

  • 支原體污染:利用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。

  • FITC被非特異性摻入:整個(gè)操作過程需保證樣品的濕潤。

熒光信號(hào)弱?
  • A Triton X-100通透或者蛋白酶K作用不充分:可調(diào)整通透劑的濃度和孵育時(shí)間。

  • 熒光淬滅:熒光劑需避光保存和使用。

  • 凋亡細(xì)胞貼壁性減弱:在操作過程中應(yīng)輕柔操作避免細(xì)胞丟失。

出現(xiàn)非特異性標(biāo)記?
  • 有些細(xì)胞和組織里的DNA酶活性比較高導(dǎo)致非特異性標(biāo)記:取完細(xì)胞或組織后立即對其進(jìn)行充分固定,阻止酶活。

  • 操作過程中可能混入DNA酶的污染。


聯(lián)系方式
手機(jī):18162686757
微信掃一掃
裕民县| 贡嘎县| 格尔木市| 合江县| 九江市| 荔波县| 策勒县| 密云县| 呼伦贝尔市| 甘德县| 津南区| 新余市| 永川市| 秦安县| 萨嘎县| 合阳县| 邓州市| 嘉禾县| 万源市| 海淀区| 新平| 西畴县| 昭通市| 沂水县| 武定县| 建阳市| 定结县| 乌兰浩特市| 哈巴河县| 喀什市| 延边| 华坪县| 昌宁县| 桃源县| 新源县| 大港区| 丰顺县| 常山县| 永康市| 靖宇县| 桓台县|