先來看一下什么是細(xì)胞凋亡~

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細(xì)胞凋亡（Apoptosis）一般是指機(jī)體細(xì)胞在發(fā)育過程中或在某些因素作用下，通過細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡(Programmed Cell Death)。

它很重要

細(xì)胞凋亡對胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生、組織內(nèi)正常細(xì)胞群的穩(wěn)定、機(jī)體的防御和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時(shí)引起的細(xì)胞損傷、老化和腫瘤的發(fā)生進(jìn)展起著重要作用，并具有潛在的治療意義。

典型特征是

細(xì)胞凋亡途徑中各事件的發(fā)生是有時(shí)序性的，即各事件按先后順序依次發(fā)生，最終導(dǎo)致凋亡小體的出現(xiàn)，細(xì)胞隨后發(fā)生凋亡。典型特征為：細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）的外翻；線粒體膜電位的喪失；細(xì)胞核凝縮和斷裂。在細(xì)胞凋亡的中晚期，核酸內(nèi)切酶（某些Caspase 的底物）的活化是關(guān)鍵的過程，在核小體之間剪切核DNA，導(dǎo)致核DNA 被裂解成180-200 bp大小的寡核苷酸片段。因此，這個(gè)過程被用于檢測凋亡，在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)典型的“DNA 梯形帶”。

但是……

這種方法既不能檢測單個(gè)細(xì)胞水平的凋亡，又不能提供細(xì)胞發(fā)生凋亡所處的組織位置和細(xì)胞分化狀態(tài)等方面的信息。

解決辦法

由脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法,即經(jīng)典的TUNEL法（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）可以解決以上問題：細(xì)胞凋亡晚期，染色體DNA雙鏈或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將熒光素/酶標(biāo)記的dUTP結(jié)合到DNA的3-OH末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測。

TUNEL法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法。對完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL法可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。

更重要的是

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AtaGenix 經(jīng)過不斷的嘗試與努力，自主研發(fā)的TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡試劑盒已經(jīng)面世！

相關(guān)信息參考官網(wǎng)

http://www.atagenix.com/

產(chǎn)品中心相關(guān)說明。

請認(rèn)準(zhǔn)如下包裝

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產(chǎn)品質(zhì)量肯定沒問題，

自測效果杠杠的~

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TNBC 組織冷凍切片（200 ×）

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LTEP 組織石蠟切片（200 ×）

該試劑盒共有三種規(guī)格

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組分	ABC001  (20T)	ABC001 (50T)	ABC001 (100T)
10x  Equilibration  Buffer	1.5 ml	1.5 mlx2	1.5 mlx4
Fluorescein-12-dUTP  Nucleotide Mix	100 μl	250 μl	500 μl
Recombinant TdT  Enzyme	20 μl	50 μl	100 μl
Proteinase K	20 μl	50 μl	100 μl

保存方式：-15 ~ -25℃保存， Fluorescein-12-dUTP Nucleotide MIX避光保存于-20oC。

試劑盒優(yōu)點(diǎn)

靈敏度高

背景染色極低，陽性染色強(qiáng)，可以在單個(gè)細(xì)胞水平檢測到細(xì)胞凋亡。同時(shí)由于凋亡早期就有DNA斷裂，可以檢測到早期的細(xì)胞凋亡。

特異性好

TUNEL檢測時(shí)通常更容易標(biāo)記凋亡細(xì)胞，而不容易標(biāo)記壞死細(xì)胞，也不會(huì)檢測出射線等誘導(dǎo)的DNA斷裂(和細(xì)胞凋亡時(shí)的斷裂方式不同)，既可以把凋亡和壞死區(qū)分開，也不會(huì)把射線等誘導(dǎo)發(fā)生DNA斷裂的非凋亡細(xì)胞判斷為凋亡細(xì)胞。

注意：極少數(shù)細(xì)胞凋亡時(shí)沒有DNA斷裂，此時(shí)不適用TUNEL法檢測。在個(gè)別類型的壞死細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)TUNEL檢測呈陽性。在需要嚴(yán)格判斷細(xì)胞凋亡的情況下，最好同時(shí)檢測多個(gè)凋亡指標(biāo)。

快速方便

只需將固定好的細(xì)胞或組織經(jīng)染色及洗滌后，即可置于熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞儀下進(jìn)行凋亡檢測，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作僅需1-2小時(shí)即可完成。

應(yīng)用范圍廣

可以用于檢測冷凍切片或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況，也可以檢測培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況。

靈活

適于固定的細(xì)胞和組織，可以使樣品收集、儲(chǔ)存和運(yùn)輸成為可能。

質(zhì)優(yōu)

每一批產(chǎn)品在出售前都經(jīng)過嚴(yán)格的檢查。

產(chǎn)品使用說明

樣品預(yù)處理

細(xì)胞樣品

細(xì)胞爬片或者細(xì)胞涂片經(jīng)PBS洗滌后，4%多聚甲醛室溫固定30分鐘，PBS洗滌，再經(jīng)終濃度為0.02 μg/μl的Proteinase K溶液通透5-10分鐘；PBS洗滌3次，每次5分鐘。

注意：細(xì)胞涂片要做好防脫處理。

組織切片

石蠟切片 

（1）室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中脫蠟10-20分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟10-20分鐘。

（2）室溫下用梯度乙醇（100%（Ⅰ）、100%（Ⅱ）、95%、80%、70%）各浸泡5分鐘。

（3）PBS浸泡潤洗切片，滴加終濃度為0.02 μg/μl的Proteinase K溶液通透15-20分鐘。

（4）PBS洗滌3次，每次5分鐘。

注意：這一步必須把Proteinase K洗滌干凈，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。

冰凍切片 

（1）將玻片短暫回溫后浸沒在4%多聚甲醛溶液 (溶于PBS)中，室溫孵育30分鐘。

（2）PBS浸泡潤洗切片，滴加終濃度為0.02 ug/ul的Proteinase K溶液通透10-15分鐘。

（3）PBS洗滌3次，每次5分鐘。

注意：Proteinase K幫助組織和細(xì)胞進(jìn)行染色劑的通透，孵育時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致組織或細(xì)胞從切片上脫落，過短則造成通透性處理不充分，影響標(biāo)記效率，為了得到最好的結(jié)果，可能需要優(yōu)化通透時(shí)間。

陽性樣本和陰性樣本的處理

（1）根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置陽性對照組和陰性對照組，按比例用去離子水稀釋DNase I Buffer，配置1x的DNase I Buffer溶液，陽性對照組滴加終濃度為10 U/ml的DNase I緩沖液，實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組滴加1x的DNase I Buffer使其完全覆蓋，濕盒孵育10 min。

（2）去掉多余的液體，并將載玻片用去離子水徹底洗3-4次。

染色標(biāo)記

參考下表配置一定量的TUNEL檢測液：

試劑組分	實(shí)驗(yàn)組	陽性對照組	陰性對照組
1x  Equilibration  Buffer	44 μl	44 μl	44 μl
Fluorescein-12 -dUTP  Nucleotide Mix	5 μl	5 μl	5 μl
Recombinant   TdT Enzyme	1 μl	1 μl	-
ddH2O	-	-	1 μl

注意：TUNEL檢測液必須一次性使用完畢，避免凍存。

（1）用去離子水按1:10稀釋10x反應(yīng)平衡液配置成1x反應(yīng)平衡液。

（2）按照表格比例配置TUNEL檢測液，每組切片滴加適量的TUNEL檢測液使其完全覆蓋（針對涂片、切片或者96孔板、48孔板、24孔板及12孔板，一般50 μl TUNEL檢測液可足夠用于大小約為2.5*2.5cm的樣本），室溫濕盒避光孵育60分鐘。

（3）將切片置于PBS或HBSS溶液中室溫浸洗2次，每次5分鐘。

（4）吸干切片上多余的水分，避免干片，滴加0.05 μg/μl的DAPI溶液，室溫濕盒避光孵育10分鐘。

（5）將切片置于PBS溶液室溫浸洗3次，每次5分鐘。

（6）用抗熒光猝滅封片劑封片。

觀察檢測

熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長范圍450-500 nm，發(fā)射波長范圍515-565 nm。

流式細(xì)胞術(shù)檢測懸浮細(xì)胞

（1）將3-5×10⁶個(gè)細(xì)胞用PBS洗2次，每次4℃，1500 rpm，離心10分鐘。然后0.5 ml PBS重懸。

（2）固定細(xì)胞：加入1 ml 4%配制于PBS中的多聚甲醛溶液，冰上放置30分鐘。

（3）4℃，1500 rpm，離心5分鐘，去上清并且重懸于1 ml PBS。重復(fù)洗一次并用0.5 ml PBS重懸細(xì)胞。

（4）通透細(xì)胞：細(xì)胞可用配制于PBS中的0.1% Triton ® X-100溶液通透，室溫放置5分鐘，或者用0.1 μg/μl的Proteinase k溶液，室溫放置5分鐘。

（5）1500 rpm，離心5分鐘，棄上清，細(xì)胞重懸于1 ml PBS。

（6）轉(zhuǎn)移細(xì)胞至一個(gè)1.5 ml的微量離心管。

（7）1500 rpm離心5分鐘，去上清并把沉淀重懸在80 μl 1x Equilibration Buffer (按1:10的比例用去離子水稀釋10x Equilibration Buffer)中。室溫孵育30分鐘。

（8）細(xì)胞在1500 rpm離心10分鐘，去上清并把沉淀重懸在50 μl TdT孵育緩沖液中。37℃避光孵育60分鐘。

（9）直接加入DAPI染液，使其終濃度為0.05 μg/ml，避光室溫孵育10分鐘。

（10）用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。測量495-520 nm的Fluorescein-12-dUTP的綠色熒光和364-454 nm的DAPI的藍(lán)色熒光。

注意：DAPI將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成藍(lán)色。只有凋亡的細(xì)胞核中有FITC-12-dUTP摻入而產(chǎn)生的綠色熒光。

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以上就是該試劑盒的使用流程。

但事情還沒有這么簡單

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 注意事項(xiàng)

試劑準(zhǔn)備階段

實(shí)驗(yàn)需自備陽性對照相關(guān)DNase I Buffer及DNase I；用于洗滌細(xì)胞的PBS或HBSS；用于封片的抗熒光淬滅封片液；用于固定的4%多聚甲醛免疫染色固定液及用于通透的含0.3% Triton X-100的免疫染色強(qiáng)力通透液。

樣品準(zhǔn)備階段 

?懸浮細(xì)胞：可以按照細(xì)胞懸液的TUNEL檢測方式操作，上流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，需要起始細(xì)胞量不低于3–5×10⁶個(gè)細(xì)胞。

?貼壁細(xì)胞：制作細(xì)胞爬片，用作爬片的玻片最好用多聚賴氨酸處理，防止脫片。

?細(xì)胞涂片：制備密度為5×10⁷ cells/ml的細(xì)胞懸液，取100 μl涂片。用來制作涂片的玻片最好用多聚賴氨酸處理。

建議：細(xì)胞樣品以細(xì)胞爬片或涂片的方式進(jìn)行檢測。

對照的設(shè)置 

• 陽性對照

切片對照可使用DNaseⅠ部分降解的標(biāo)本。細(xì)胞對照可使用地塞米松（1 um）處理3-4 h 的大、小鼠胸腺細(xì)胞和人外周血淋巴細(xì)胞。

意義：可判斷實(shí)驗(yàn)方法和操作有無問題。

• 陰性對照

不加TdT酶，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

意義：排除凋亡外的非特異性染色。

溫馨提示 

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究使用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。 為了您的安全，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

盡管如此，

也不排除實(shí)驗(yàn)過程中會(huì)出現(xiàn)一些問題，

比如：

熒光高背景？

• 高速分裂或增殖的細(xì)胞，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核DNA斷裂。

• TUNEL反應(yīng)過強(qiáng)：可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液稀釋TdT酶2-5倍后再操作。稀釋后的TdT酶需當(dāng)日使用完畢。

• 支原體污染：利用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。

• FITC被非特異性摻入：整個(gè)操作過程需保證樣品的濕潤。

熒光信號(hào)弱？

• A Triton X-100通透或者蛋白酶K作用不充分：可調(diào)整通透劑的濃度和孵育時(shí)間。

• 熒光淬滅：熒光劑需避光保存和使用。

• 凋亡細(xì)胞貼壁性減弱：在操作過程中應(yīng)輕柔操作避免細(xì)胞丟失。

出現(xiàn)非特異性標(biāo)記？

• 有些細(xì)胞和組織里的DNA酶活性比較高導(dǎo)致非特異性標(biāo)記：取完細(xì)胞或組織后立即對其進(jìn)行充分固定，阻止酶活。

• 操作過程中可能混入DNA酶的污染。